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性逆转石斑鱼脑垂体差异表达cDNA克隆的筛选及其表达研究

胡国库

  以17-α甲基睾丸酮投喂赤点石斑鱼(Epinephelus akaara),成功地获得了性逆转的有功能的雄鱼。用SMART cDNA合成和长片段PCR技术构建了性逆转前后脑垂体cDNA文库;用抑制消减杂交技术建立了石斑鱼性反转前后抑制性差减文库。对获得的560个雄鱼脑垂体PCR阳性克隆和350个雌鱼脑垂体PCR阳性克隆进行斑点杂交,共筛选到103个差异表达cDNA片段。对其中29个克隆进行了测序,对部分克隆进行了虚拟Northern杂交鉴定,将测定的序列与GenBank中的已知基因序列进行同源性比较,发现有6个片段为促性腺激素α亚基前体基因(GenBank注册号:AY207430),与同属不同种的石斑鱼促性腺激素α亚基前体基因有97%的同源性;1个片段为生长激素前体(GenBank注册号:AY207431),与同属不同种的石斑鱼生长激素前体基因有99%的同源性;其余22个cDNA片段与GenBank中的序列无明显同源性。经快速末端扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术获得促性腺激素α亚基前体基因5’-端和3’-端序列,并拼接得到该基因的全长cDNA序列。促性腺激素α亚基前体cDNA全长673bp,从第76个核苷酸到429个核苷酸编码117个氨基酸残基。虚拟Northern杂交表明,促性腺激素α亚基前体基因在雄性石斑鱼脑垂体中差异表达,在雌鱼脑垂体cDNA未检测到杂交信号。组织RT-PCR显示,促性腺激素α亚基前体基因在雄性石斑鱼脑垂体中表达量很高,而在心、肾、脾、肝、性腺、肌肉、脑的其它部位以及雌鱼脑垂体中未检测到转录产物或只有极少的转录产物。将此基因与表达载体pET-DsbA2.0连接,经表达、纯化,获得融合表达的纯化产物,为进一步的功能研究奠定了基础。……   
[关键词]:石斑鱼;性逆转;垂体;促性腺激素;抑制消减杂交;RT-PCR分析
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:四川大学2003年