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青稞中β-1,3-葡聚糖酶分离纯化及性质研究

丁平

  β-1,3-葡聚糖酶[E.C.3.2.1.39]存在于大多数高等植物中,并由一个小基因家族编码,在植物不同的生理活动中起着重要的作用。如细胞分裂、小孢子发生、花粉的形成、受精作用和胚的发生,并参与了植物对损伤,低温、臭氧和UV B等做出的生理反应,而且是植物种子发芽和防御反应中的关键物质。青稞是我国青海、西藏特有的高原作物,研究发现青稞种子中含有较高的β-1,3-葡聚糖酶,但是未有从青稞中提纯β-1,3-葡聚糖酶的文献报道。本文运用硫酸铵沉淀、DEAE-A25和CM-Cellose离子交换柱层析、Sepharyl-S-300-HR的FPLC,从青稞发芽种子的胚中提纯得到一种β-1,3-葡聚糖酶,分析了此酶的等电点、最佳反应温度和最佳反应pH,运用非变性凝胶电泳胶板直接活性染色方法对酶进行了快速鉴定,测定了近紫外和远紫外圆二色光谱,并计算出酶二级结构和三级结构,并结合酶活测定和内源荧光光谱分析,考察了金属离子对酶的影响,并对酶热稳定性和荧光发射光谱变化进行研究。结果表明:采用上述方法,可以从38克发芽青稞种子胚中提纯得到0.98毫克的β-1,3-葡聚糖酶,此酶可以特异水解海带多糖。在非变性PAGE银染时只出现一条带,活性染色也在同一位置出现了唯一条亮红色的活性带。SDS-PAGE表明纯化酶的分子量为31kDa,属于单亚基酶。聚焦电泳分析等电点pI值为8.1,为碱性酶蛋白。此酶的最适反应温度和反应pH分别为35℃和5.0。根据CD谱计算酶的二级结构,表明其含有14.8%α-螺旋,22.93%β-折叠和62.2%无规则卷曲。外加金属离子对酶有激活作用,且与金属离子的种类、价态和浓度相关,其中二价离子的作用大于一价离子。特别是低浓度Ca~(2+)或Ba~(2+)可以显著提高酶活。蛋白内源荧光光谱分析也表明,Na~+对酶的荧光发射峰的影响较小;而加入Mg~(2+),Ca~(2+)或Ba~(2+)后荧光强度下降及发射峰红移,且以Ca~(2+)和Ba~(2+)影响最大。这可能是金属离子与蛋白质的侧链基团作用,而使酶分子中的Trp和Tyr残基的微环境发生了改变。热稳定性实验结果表明,此p一1,3一葡聚糖酶对热敏感,随温度升高,酶活力下降;内源荧光分析也显示荧光强度增加、最大发射峰蓝移。此酶可能属于热敏感蛋白,与其二级结构中无规则卷曲较多,而Q一螺旋和p一折叠较少有关。……   
[关键词]:青稞;β-1;3-葡聚糖酶;活性染色;圆二色光谱;荧光光谱;金属离子
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:四川大学2003年