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免疫耐受相关分子sHLA-G1的表达、纯化及其活性分析

汤海洋

  HLA-G是一种非经典的HLA-I类基因,与人免疫耐受相关。限定性表达于母胎界面的绒毛膜滋养层细胞,在诱导母体对半同种异体胎儿的妊娠免疫耐受起着重要作用。一些报道还发现黑色素瘤细胞中有HLA-G高水平的mRNA转录及蛋白表达,从而推测HLA-G可能在诱导肿瘤细胞免疫逃逸。相对于经典的HLA-Ia类分子,HLA-G与其他非经典的HLA-Ib类一样在基因和蛋白水平上都表现出极低多态性,目前已公布的HLA-G等位基因仅有16种。HLA-G另一显著特征就是其mRNA初始转录经选择性接切产生至少7种同种异型体,包括4种膜结合型(HLA-G1、-G2、-G3、-G4)和3种可溶性蛋白(sHLA-G1、G2、-G3)。尽管目前对于HLA-G抑制NK细胞活性功能研究的比较多,也发现了许多NK细胞抑制性受体,但是对于HLA-G究竟如何与NK细胞受体作用,以及受体识别后抑制信号的传递还有待于进一步的研究证实。为阐明HLA-G与NK细胞的识别机制以及HLA-G参与免疫耐受作用的分子机理,我们应用RT-PCR方法从人外周血单个核细胞中克隆包含HLA-G1完整阅读框的cDNA序列。在此基础上,PCR扩增编码HLA-G1胞外区片断,构建了pGEM-T-sHLA-G1克隆载体,进一步将其sHLA-G1亚克隆到表达载体pGEX4T2上,构建了sHLA-G1原核表达载体pGEX4T2-HLAG-G1,转化大肠杆菌DE3,经IPTG诱导表达出GST-sHLA-G1融合蛋白。SDS-PAGE显示融合蛋白分子量与期望值一致为56kD。Western blot显示融合蛋白能被HLA-G单克隆抗体87G识别。融合蛋白在原核大量表达始终形成包涵体,HLA-G胞外区本身就含有两二硫键,这为蛋白质正确折叠造成很大困难。因此,对表达产物形成的包涵体进行了溶解、洗涤、复性等一系列过程,摸索出融合蛋白GST/sHLA-G复性最适的过程参数,提高复性率。用亲和层析方法纯化融合蛋白GST/sHLA-G1,~(51)Gr释放实验证实了可溶性HLA-G1具有体外抑制NK细胞杀伤活性的作用,也说明我们通过原核表达首次获得具有生物学活性的sHLA-G1融和蛋白,为进一步研究HLA-G与NK细胞受体相互作用的分子机制奠定了基础。……   
[关键词]:HLA-G;原核表达;蛋白纯化;免疫耐受
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:西北农林科技大学2003年
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