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淋巴瘤免疫组化和基因诊断标准化的初步研究

柳刚

  目的恶性淋巴瘤(malignant lymphoma,ML)是我国十大恶性肿瘤之一,该肿瘤分类复杂、预后差、临床诊断极为困难,误诊率高达30%。目前,ML的诊断主要依靠HE组织形态学和免疫组化,国内部分大医院已建立了以HE组织形态学为基础,免疫组化、基因诊断为辅的三结合的恶性淋巴瘤诊断方案,确诊率达到95%以上。但目前免疫组化常用的CD20、CD45R0和LCA等抗体受到多种因素的影响,可出现假阳性或假阴性,迫切需要能在淋巴组织增生性疾病中稳定特异表达的标准化抗体;基因诊断应用试剂未标准化,条件、方法不统一,阳性检出率报道不一,结果不稳定,难于推广。针对上述问题,我们将在上述两个方面做进一步的研究,首先,免疫组化方面比较B细胞特异性激活蛋白(B-cell-specific activator protein,BSAP)与CD20在淋巴组织增生性疾病中的表达情况,论证BSAP成为临床鉴定淋巴瘤类型标准化抗体的可能性;其次,基因诊断方面,比较使用95%酒精、10%福尔马林液、中性缓冲甲醛液和4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液等常用固定剂固定新鲜淋巴组织后对其切片HE染色、组织DNA保存质量的综合影响,寻找其最佳应用固定剂并明确其最佳应用温度及固定时间。方法(1)观察63例淋巴组织增生性疾病的组织病理学形态,按WHO新分类方案进行淋巴瘤分型,结合常规的CD45RO,采用免疫组织化学SABC法同步检测比较BSAP和CD20的表达;(2)收集30例新鲜扁桃体组织,应用95%酒精、10%福尔马林液、中性甲醛缓冲液和4%多聚甲醛液等固定剂分别同时固定,石蜡包埋切片,HE染色,明确组织类型及比较其染色效果;15例应用上述不同固定剂分别固定组织常温下(20℃)不同时间段(1h、2h、4h、8h、24h、48h、72h),另15例在不同应用温度(-20℃、-4℃、20℃)下应用上述不同固定剂分别固定8h,组织消化提取其DNA,量取其0D值并进行PCR凝胶电泳比较。结果(1)63例淋巴组织增生性疾病中,9例淋巴结反应性增生的B淋巴细胞,34例B细胞性淋巴瘤的瘤细胞均表达BSAP和CD20,但BSAP的中等到强阳性表达率(69.8%)高于CD20(53.5%),二者差异无显著性(P>0.05),6例霍奇金淋巴瘤H/RS瘤细胞表达阳性率为83.2%,14例T细胞淋巴瘤的肿瘤细胞均不表达BSAP;(2)30例新鲜扁桃体组织分别固定后,石蜡包埋组织切片HE染色辨认并比较,中性缓冲甲醛液和10%福尔马林液固定组组织结构清楚,染色对比明显,95%酒精组组织变脆,增加了切片难度,镜下观察组织容易变形;在7个应用时间段和3个应用温度条件下,不同固定剂固定后提取DNA的OD值比较,四个固定组及对照组在7个应用时间段和3个应用温度条件下DNA浓度和比值均无显著性差异(P>0.os);4种固定剂组提取DNA在1h、Zh、4h、sh时段PCR扩增阳性率均为100%,95%酒精组DNA在7个时段阳性率均为1 00%,中性缓冲甲醛液组在48h、72h时段阳性率有下降,分别为93.3%、93.3%,4%多聚甲醛液和10%福尔马林液在24h、48h、72h时段阳性率分别为93.3%、86.7%、80.0%和86.7%、80.0%、66.7%;在应用的三个不同温度条件下固定8h后,4个固定组的DNA PCR扩增阳性率均为100%;对照组在所有应用条件下提取DNA扩增阳性率均为100%。结论(1) BS妙表达定位于B淋巴细胞的核内,清晰易见,在B细胞性淋巴瘤显著表达多呈强阳性,可作为标记B细胞的标准化抗体用于淋巴瘤的分型与鉴别诊断;(2)中性甲醛液和10%福尔马林液对于组织结构的保存最好,95%酒精较差:95%酒精和中性甲醛缓冲液对于淋巴组织DNA的保存效果最好,10%福尔马林液因为其对DNA的降解作用,对PCR扩增效果影响最大,4%多聚甲醛液也有较大影响;在72h以内,离体组织的DNA分解并不明显,温度影响也不大;综合比较,对于新鲜淋巴组织,中性甲醛液为最佳应用固定剂,其最佳应用时间是5~24h,固定72h以内温度影响不大。……   
[关键词]:淋巴瘤;BSAP;诊断;方法学;固定;DNA
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:中国人民解放军第一军医大学2003年