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金水清对大鼠肾小球系膜细胞的影响

张雪荣

  目的:通过对大鼠肾小球系膜细胞(glomemlar mesangial cells MC)的体外培养,观察中药金水清对MC增殖、IL-6和Ⅳ型胶原表达以及MC凋亡的形态学变化和细胞周期及凋亡的影响,探讨金水清对大鼠系膜细胞可能的作用机制,从而为临床应用金水清治疗小儿肾性血尿提供客观的实验依据。方法:体外培养的大鼠肾小球系膜细胞系,经不同浓度的金水清处理后,分别检测:(1)台盼蓝染色法观察金水清对大鼠系膜细胞的毒性作用;(2)噻唑蓝(MTT)法检测系膜细胞的增殖;(3)荧光显微镜下观察系膜细胞的凋亡形态;(4)流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率;(5)双抗体夹心ELISA法检测IL-6,Ⅳ型胶原的含量。结果:1、经台盼蓝染色显示,金水清各组24、48、72h细胞活力达90%以上。经x~2检验,金水清各浓度组细胞活力与正常组比较,无显著性差异(P>0.05),说明金水清在本次实验中对系膜细胞无明显细胞毒作用。2、MTT OD值显示,各组与空白对照组比较,24h OD值呈下降趋势,其中阳性对照组(DEX)、金水清(Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ)组差异非常显著(P<0.01),Ⅶ组差异显著(P<0.05);48h OD值也呈下降趋势,阳性对照组(DEX)、金水清(Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ)组差异非常显著(P<0.01),而Ⅶ组无差异(P>0.05)。说明金水清各浓度组及DEX组作用于MC,24h、48h时对其增殖有抑制作用,并呈浓度依赖关系(48hⅦ组除外)。金水清各组与阳性对照组(DEX)比较,24h、48h OD值呈上升趋势,其中金水清(Ⅲ)组无显著性差异(P>0.05),金水清(Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ)组差异非常显著(P<0.01),说明金水清各组抑制MC增殖的程度,以高浓度Ⅲ组为强,与DEX效果相当,其余浓度组24h、48h抑制作用都比DEX差。3、大鼠系膜细胞生长形态学观察经中药金水清及DEX处理24h后,光学镜下可见部分贴壁生长的MC附壁能力减弱,易从培养皿壁上脱落下来,浮悬于培养液中,相邻细胞间连接性降低,细胞形态变圆,体积缩小,核固缩出现,核颜色加深,折光性增强。空白对照组的细胞贴壁生长,几乎无脱落,胞浆饱满,舒展生长良好,相邻细胞生长融合成片。荧光显微镜下见不同浓度药物组及地塞米松组的MC均有核仁碎裂,呈大小不等、形态不规则的月牙状、散射状、梅花状,即为典型的细胞凋亡形态,同时可见少量完整和正在凋亡过程中的MC;其中以金水清Ⅲ组的凋亡细胞最多。空白对照组MC细胞核均完整,未见有凋亡形态。4、在本实验中,以金水清处理后的细胞,在流式细胞仪分析直方图上,其细胞周期的分布发生了改变,MC的G_0/G_1期逐渐升高,而S期和G_2期细胞比逐渐下降。且凋亡率随着药物浓度的升高而升高,湖北中份攀院硕士研究生瀚文经x’检验,金水清各浓度组及地塞米松组凋亡率与空白组比较,差异显著(P<0.05)。提示金水清对MC的作用环节,主要是影响细胞周期Gt期向S期的转变过程,将MC阻滞在G,期,从而减少进入S期的细胞数目,减少其有丝分裂,抑制其增殖.5、经双抗体夹心ELISA法检测,与空白对照组比较,阳性对照组(DEx)、金水清各组工L一6的含量呈下降趋势,差异非常显著(P<0.01),说明金水清各组均可抑制IL一6的分泌;与阳性对照组(DEX)比较,金水清111组低于DEX组,有显著差异(P<0.01),Iv、V、Vl、vll组高于DEX组,有差异(P<0.05或P<0.01).说明金水清抑制IL一6的分泌以m组作用显著,优于DEx,其余各组抑制作用比DEX差.与空白对照组比较,阳性对照组(DEX)、金水清各组W型胶原的含量呈下降趋势,有显著性差异(P<0.01),说明金水清各组均可抑制W型胶原的分泌;与阳性对照组(DEX)比较,金水清111、W组低于DEx组,有显著差异(P<0.01或P<0.05),V、Vl、vll组高于DEX组,有显著差异(P<0.01).说明金水清抑制W型胶原的分泌以m、W组作用显著,优于DEX,其余各组抑制作用比DEX差.结论:MC是金水清发挥作用的重要靶细胞,金水清抑制系膜细胞增殖可能通过以下环节:(l)减少细胞有丝一分裂,干扰细胞周期,抑制系膜细胞的增殖及代谢活性;(2)诱导系膜细胞的凋亡;(3)降低IL一6及Iv型胶原的合成与分泌。从而发挥抑制MC增殖,减少细胞外墓质(extracellular matrix ECM)的堆积,拮杭细胞因子的不良作用,达到治疗小儿肾性血尿,并防治肾小球硬化,延缓慢性肾脏病理进程的目的.……   
[关键词]:金水清/中医药疗法;血尿;系膜细胞/增殖;细胞凋亡;细胞因子/IL-6;细胞外基质/IV型胶原
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:湖北中医学院2003年