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猪瘟伪狂犬病重组病毒活疫苗的研究

徐志文

  试验中采用直接荧光抗体检测、兔体交互免疫试验和ELISA检测方法确诊猪瘟临床病例,分离了猪瘟野毒MZ株。采用RT-PCR扩增了MZ株的囊膜糖蛋白E2基因全序列,克隆于质粒PUC18中并进行了核苷酸序列测定及氨基酸序列推导。将其与猪瘟病毒(HCV)石门株(SM)株和Brescia株对应序列进行了同源性比较,结果核苷酸同源性为95%和94%,氨基酸为96%和94.2%。克隆片段长1285bp包含HCV E2基因全序列,编码包含信号肽及跨膜区在内的完整囊膜糖蛋白E2氨基酸序列。对该氨基酸序列进行疏水性及氨基酸变异分析,未见其抗原决定簇发生明显变异。为了构建猪瘟伪狂犬病重组病毒,我们采用BamHI和HindIII双酶切重组质粒PhcvE2获得E2基因片段,与经BclI和EcoRV双酶切处理的PP63LacZ质粒DNA连接转化大肠杆菌DH5a,构建了转移重组质粒PP63LacZE2。经BclI和SacI双酶切鉴定证明该重组质粒PP63LacZE2含有HCV E2基因。采用磷酸钙转染系统,将伪狂犬病三基因缺失疫苗SA215株DNA与PP63LacZE2 DNA共转染Vero细胞,获得SA215(A)1、SA215(A)2和SA215(A)3等12个经同源重组后在含X-gal覆盖琼脂中产生的白色病毒噬斑。以光生物素标记的HCV E2基因为探针进行初步鉴定,结果均为阳性。挑选SA215(A)1株作BamHI酶切和southern转印杂交鉴定,结果表明重组病毒构建是成功的,将其命名为SA215(A)。直接荧光抗体检测、病毒蛋白质SDS-PAGE电泳和western免疫印迹检测结果表明HCV E2基因在重组病毒内获得表达,产生大小为51Kd左右囊膜糖蛋,白E2。对重组病毒SA215(A)株进行部分生物学特性研究,经过培养特性观察试验表明该毒株可适应Vero细胞、BHK21细胞、IBRS细胞、PK15细胞、MDBK细胞和鸡胚成纤维细胞,但对不同细胞系表现有一定的差异。比较发现其与SA215株致细胞病变能力存在很大差异,在Vero细胞上重组病毒SA215(A)株引起细胞病变所需时间延长,且最终形成的空斑大大小于亲本病毒SA215。重组病毒SA215(A)株能被特异性抗伪狂犬病病毒血清完全中和,其仍具有亲本病毒血清学特性。电镜观察未发现重组病毒SA215(A)与亲本病毒之间存在形态学差异,但可见其增殖能力明显降低。核酸杂交检测结果表明,SAZ巧(A)株与SA215株在动物体内分布情况一致,仅能定植于三叉神经节以下。SAZ巧(A)株lml接种21日龄健康仔猪(伪狂犬病和猪瘟检测阴性),在接种后28天用10毕FU的PRV Fa强毒株进行滴鼻攻毒,42天用猪瘟强毒SM株血毒lml肌肉注射攻击,结果表明接种猪能抵御两次病毒攻击,而同条件下对照结果成立,表明SAZ 15(A)株具有良好免疫原性。以5 x 10‘、1 x 10,、5 x 1 05和1 x 1 06PFU等不同剂量的SAZ15(A)株接种21日龄健康仔猪(伪狂犬病和猪瘟检测阴性),按上述条件进行PRv和HCv攻毒试验确定其最低免疫剂量为1 x 1 osPFU。以重组病毒SAZ 15(A)株为种毒,我们试定了猪瘟伪狂犬病重组病毒活疫苗的生产检验工艺,选择鸡胚成纤维细胞为生产用细胞,vero细胞为检验用细胞,试制了01001、01002和01003等3批猪瘟伪狂犬病重组病毒活疫苗。对每批疫苗半成品和成品进行抽样检验,结果3批疫苗均为合格产品。试制的3批疫苗物理性状检验合格,无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染;剩余水分分别为2.6%、2.7%和2.3%:疫苗真空度检测结果均为ZPa:批间毒价稳定,每头份疫苗病毒含量均在1护PFU以上。根据保存期试验所得结果:猪瘟伪狂犬病重组病毒活疫苗SA215(A)在一200C保存1年未引起毒价下降;4一80C保存1年毒价仅轻微下降,但仍然满足疫苗最低免疫剂量要求;室温条件下保存时短期内即表现毒价明显下降,故将疫苗SAZ15(A)保存期确定为4一80C保存1年。安全性试验结果表明不同剂量的疫苗SAZ15(A)接种经检测为伪狂犬病和猪瘟阴性的新生仔猪、21日龄健康仔猪及妊娠母猪均未见异常反应,证明了该疫苗的安全性。通过在接种疫苗后不同时间内对动物进行血清抗体检测或攻毒后保护率计算,结果表明测定期内疫苗SAZ15(A)接种动物均可抵御PRV和HCV强毒攻击,结合伪狂犬病发病特点将疫苗的免疫期定为28周。上述试验结果说明,重组病毒SAZ15(A)是一株优秀的猪瘟、伪狂犬病二价疫苗候选株。……   
[关键词]:伪狂犬病;猪瘟;重组病毒;活疫苗
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:四川农业大学2003年