手机知网 App
24小时专家级知识服务
打 开
手机知网|搜索

鼠疫耶尔森氏菌AFLP分型方法的研究

裴德翠

  目的:扩增片段长度多态性分析(Amplified fragment length polymorphism,AFLP)是一种基于PCR的高分辨率DNA指纹分析方法,是一种新的DNA分子标记技术,用荧光素标记引物进行PCR扩增的AFLP技术为FAFLP技术。本实验旨在建立FAFLP技术平台并用此技术对来自我国10个自然疫源地的261株鼠疫耶尔森氏菌进行基因分型研究,了解我国鼠疫耶尔森氏菌AFLP基因型与流行病学及自然环境的关系,准确追踪突发病原的来源,为鼠疫的预防及诊疗提供依据。方法:从10个自然疫源地中选出261株不同来源的菌株(见表1),采用常规碱裂解法提取DNA,溶于TE缓冲液(10mmol/L Tris-HCl pH7.6,1mmol/L EDTA.Na_2)中,用紫外分光光度计(Beckman DU600)测定OD值,确定其浓度。另外选两株分别按三种不同的培养时间和连续培养三代的方法培养细菌,并按上述方法提取DNA。用ApaⅠ/TaqⅠ,EcoRⅠ/MseⅠ,HindⅢ/TaqⅠ三种内切酶组合对两株菌进行酶切,选出最佳内切酶组合。根据Janssen等设计并合成了5条EcoRⅠ引物,9条MseⅠ引物及相关接头,用低频限制性内切酶EcoRⅠ和高频限制性内切酶MseⅠ消化鼠疫耶尔森氏菌基因组DNA,酶切片段与带有特异性酶切位点的接头连接,连接产物按1:10稀释成PCR模板,经荧光素标记的EcoRⅠ和非荧光素标记的MseⅠ引物对其进行PCR扩增,扩增产物与内标及去离子甲酰胺按一定的比例混合并变性,加样于ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer进行毛细管电泳检测,选择不同的电泳参数及分析参数,数据经Data collection software收集,并用GeneScan SoftWare、RAPD、PHYLIP和Treeview等软件进行分析。实验中我们用14条引物组合成的45对引物对两株菌进行了初试,筛选出扩增片段比较合适的引物对。同时对PCR条件进行了优化组合,通过分别采用不同的镁离子和模板浓度,dNTPs,引物及Taq DNA聚合酶的用量对两株菌进行扩增检测,选出最佳组合,利用此组合做了三次重复性实验。结果:三组内切酶酶切产物电泳结果显示,Ec口尺介九方eI酶切效果最好。用45对引物对连接产物进行PCR扩增,扩增产物毛细管电泳结果表明,EcoRI刁从方eI一A,C,qT,CA五对引物扩增结果电泳图谱较理想,通过重复性实验选择了Ec口Rl砚又价更夕el一C引物。PcR优化实验表明,Mg2+浓度的改变对结果影响最大,浓度太低扩增带数明显减少,随着浓度的升高,扩增条带增多,但是太高会导致人为峰,信噪比降低,在Zmmol/L和2.smmol/L时电泳结果较理想,重复性好,实验时采用2.smmol/L。模板浓度的改变也会影响实验结果,浓度太低扩增出的带少且信号弱,随着模板浓度的升高,片段信号逐渐增强,但太高信号强度会超出仪器的正常检测范围,同时出现Pul卜叩峰(pull一uP峰是一种出现在另一颜色峰下的非PCR产物相关的峰,其峰的颜色与其上方的峰颜色不一样,其上方的峰因此峰的出现而峰高被pullup 100一200rfu见genesean referenee即ide3一11),在实验中采用10一40ng时效果相差不大,电泳结果均较合适,实验时采用1 ong。dNTPs、引物及DNA聚合酶的用量对结果也有一定的影响。根据优化方案,对来自我国10个自然疫源地的261株鼠疫耶尔森氏菌进行了分析,表明了鼠疫耶尔森氏菌是一个非常近源的种,基因组相似度在97%以上,可分为7个AFLP基因型。10个自然疫源地在7个基因型中分布较散,但每个基因型均以某一个或几个自然疫源地为主,基因型与我国鼠疫自然疫源地及流行情况有一定的关系。两株菌的连续三代培养物和不同时间培养物FAFLP分析结果表明,同一株菌不同传代培养物其AFLP基因型不同。结论:FAFLP技术虽然具有快速,简捷,重复性较好的优点,但由于鼠疫耶尔森氏菌基因组中含大量重复序列,基因流动性大,同一株菌基因组在传代的过程中可发生重组等改变,因此FAFLP技术并不是非常适合鼠疫耶尔森氏菌的分型。更为有效的用于鼠疫耶尔森氏菌基因分析的方法有待于进一步研究。……   
[关键词]:扩增片段长度多态性分析(AFLP);FAFLP;DNA分子标记技术;鼠疫耶尔森氏菌;基因型
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:中国人民解放军军事医学科学院2003年