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A型产气荚膜梭菌α毒素基因的克隆、表达及免疫学活性研究

林明辉

  α毒素是A型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens type A,CPA)引起气性坏疽的最主要致死因素,也是重要的生物毒素战剂,目前尚无有效的防治方法。克隆A型产气荚膜梭菌α毒素基因,实现在大肠杆菌中的高效表达,研究重组毒素的生物学活性及免疫学活性,对α毒素的检测、疫苗及抗毒素的制备具有重要意义。用PCR方法从A型产气荚膜梭菌菌株NCTC64609中扩增到了α毒素全基因(cpa1229基因)及C端片段(cpa408基因),将两片段分别克隆至pMD18-T Vector测序鉴定后,置于含PRPL启动子的原核表达载体pBV220的受体菌DH5α中,经42℃温度诱导,cpa408基因在分子量约15KD处得到了高效表达,表达量达43.75%且表达产物主要以可溶形式存在。经Western blot鉴定,表达蛋白能被抗α毒素血清所识别。将表达产物经80%饱和硫酸铵一次沉淀后,进行透析,上凝胶过滤层析柱分离纯化,得到了纯度95%以上的表达目的蛋白。用纯化的表达产物,腹腔注射免疫昆明小鼠,进行免疫保护实验,结果免疫组8只小鼠全部存活,得到了100%的保护,而对照组8只小鼠全部死亡。同时,多点肌肉注射免疫SPF级30周龄产蛋鸡;收集免疫后鸡每周所产蛋,混和卵黄液提取鸡卵黄抗体IgY后,取适量样品,ELISA法测定卵黄液中抗体滴度值,结果所制备的抗体滴度一般在1:6400至1:12800之间,最高值达1:25600;以双向免疫扩散和ELISA方法,用IgY和标准抗α毒素血清检测cpa408表达蛋白及A型产气荚膜梭菌NCTC64609浓缩培养上清,两者均能与IgY及标准抗α毒素血清特异反应。昆明小鼠主动免疫保护实验及鸡卵黄抗体制备实验显示,cpa408基因表达产物具有良好免疫原性,其免疫昆明小鼠后产生的抗体对小鼠具有保护作用,从而为下一步α毒素疫苗及抗毒素的研究奠定了基础,所制备的IgY抗体为α毒素的检测提供了可靠的材料。……   
[关键词]:A型产气荚膜梭菌;α毒素;基因;克隆;表达;免疫学活性
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:中国人民解放军军事医学科学院2003年