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胃癌相关抑癌基因CDH1、Ago基因突变分析

敖杨

  前言胃癌是我国人群中发病率和死亡率均占第一位的恶性肿瘤,阐明胃癌发生的分子机理进而指导肿瘤防治,在我国具有特殊的重要性和紧迫性。胃癌的发生是一个多基因、多阶段、多因素参与的过程,其分子生物学改变极其复杂,通常涉及多个抑癌基因的失活。Knudson于1971年提出的“两次打击”学说为肿瘤遗传学工作者提供了普遍接受的肿瘤发生机理学说,成为探讨肿瘤发生机制研究的理论基础。1998年Guilford等在新西兰Maori人群3个胃癌家系中发现E-cadherin编码基因CDH1的种系突变,首次提供了CDH1基因作为抑癌基因及胃癌遗传易感基因的关键证据。此外,胃癌中常见周期素E扩增和高表达现象,亦可见染色体4q丢失,提示有可能存在位于4q上的Ago基因失活。因此,本文联合应用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)和变性高效液相色谱(denatured high performence liquid chromatograghy,DHPLC)技术对胃癌相关抑癌基因CDH1和Ago基因进行了突变筛查,较全面地研究了CDH1和Ago基因突变在胃癌发生发展中的作用。材料与方法1.标本:进展期新鲜胃癌及对应癌旁正常组织83例,其中中分化胃癌34例,低分化胃癌49例,其中包括青年人胃癌(发病年龄<40岁者)8例。另有青年人胃癌外周血14例。所有标本均来自中国医科大学附属第一临床医院肿瘤科手术。2.基因组DNA提取:手术切取新鲜胃癌组织及对应癌旁正常组织,采用传统酚一氯仿抽提法提取基因组DNA。3.CDHI及Ago基因突变检测:联合应用PCR一DHPLC技术对胃癌相关基因CDHI和Ago基因进行突变筛查并测序确认。3.1引物设计:设计扩增CDHI和Ago基因全部外显子引物,引物序列位于每个外显子两侧的内含子内,每个扩增子包含一个外显子和两侧的拼接部位。3.2 DHpLC突变筛查:根据每个扩增子的解链温度曲线确定检测温度,对每个样本进行突变检测。3.3测序分析:有色谱峰型改变的样本,其PCR产物纯化后送上海生工公司测序部测序分析。实验结果1.CDHI基因突变筛查结果CDHI基因第14外显子有13例出现DHPLC峰型改变,测序发现位于第2254位碱基C*T转换(AAC*AAT),但未导致编码氨基酸(天冬酞胺)的改变,该基因变异存在于13(13/97)例胃癌患者中。CDHI基因第5内含子第688位碱基后第33位G一)A转换,存在于1(1/97)例胃癌患者中。2.Ago基因突变筛查结果在22例进展期胃癌组织中,对照相应正常组织,没有发现Ago基因DHPLC色谱峰型异常。结论1.联合应用PCR一DHPLC方法检测到CDHI基因的两个新的多态,分别位于第5内含子第.688位碱基后第33位G叶A转换和第14外显子第2254位碱基C、T‘转换(AAC*从T),其中第·2·14外显子多态出现频率较高(13/97)。2.Ago基因突变失活可能与胃癌的发生发展关系不大。3.PCR一DHPLC是一种有效的突变筛查方法。……   
[关键词]:胃癌;CDHl基因;Ago基因;聚合酶链反应-变性高效液相色谱
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:中国医科大学2003年