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乙脑病毒prME与E蛋白编码基因的构建、表达及DNA免疫的研究

冯国和

  目的该研究从乙脑病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)JaGAr-01株中获取prME与E蛋白编码基因,构建到带有FLAG标记基因、CMV以及T7噬菌体启动子的真核表达载体pcDNA(FLAG)3上,分别命名为pJME与pJE;采用脂质体转染法分别将二重组质粒转染于HepG2、KN73以及COS-1动物细胞中,探讨质粒转染剂量和所编码的蛋白表达量之间的关系;分析由pJME与pJE编码的prME与E蛋白在不同哺乳动物细胞内的表达特点;采用肌肉注射与基因枪注射方式将pJME与pJE注射于鼠体内,分析由不同质粒所诱导产生的中和抗体滴度与保护性免疫变化;探讨在转染细胞内蛋白表达水平和DNA免疫效率的相关程度。材料与方法细胞、病毒、载体及动物:HepG2与COS-1细胞系分别来自于人肝癌细胞和猴肾细胞,培养于37℃、5%CO_2与含10%胎牛血清(Fatal calf serum,FCS)的Dulbeco modified eagle medium(D-MEM)中;KN73细胞也来源于一种人肝间质细胞,培养于37℃、5%CO_2与含10%FCS的RPMI1640中,均用于细胞转染实验。乳地鼠肾细胞(Baby hamaster kidney,BHK)培养于37℃、5%CO_2与含1%FCS的Eagle medium(E-MEM)中,用于80%空斑减少中和试验(Plaque reduction neutralization test,PRNT80)。C6/36细胞系来自于蚊细胞并培养于28℃、含10%FCS与相应氨基酸的E-MEM中,用于JEV培养。野生型并具神经毒力的JEV JaGAr-01株,用于质粒构建及以后动物实验中的病毒攻击。所用表达载体为pcDNA(FLAG)3,在其多克隆位点区域内的HindⅢ/BamHI酶切位点之间插入FLAG标记基因(编码FLAG蛋白含8AA ,分子量约1KDa),其同时带有巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)与T7噬菌体启动子。选用雌性、4周龄Balb/c鼠进行DNA免疫动物实验,免疫鼠在病毒攻击后被观察21日,每天检查其生存状态。JEV prME与E蛋白编码基因的重组构建:从JEV感染的C6/36细胞中提取细胞内总RNA。RT-PCR方法分别扩增出JEV prME(2001bps)与E (1500hP)基因片段。两个不同 5’末端引物:5’-ATG AAG hG TCAAAT’ITC CAG GGGA,符合于 prME区域第 477至 501 核昔酸(nucleohde,nt)位点;5’-’I’IVf AAT TGT CTG GGA ATG GG,位于 E区域第978至997nt位点。共用相同 3’末端弓!物:5’-AGC ATG CAC Aw GCT CGC TAA GAA,互补于2454至 2477nt位点。此外,限制性内切酶 BaxnHI合成于 5’末端引物,Eec-Al合成于 3’末端引物。使用 QIAqUickPCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化 RT-PCR产物,ABI-PRSM*310Genetic Analyzer(Pekin-Elmer/Applied)测序分析,并与发表的JaGAr-01株核酸序列进行比较。将BamHI/EcoAI酶消化的RT-PCR产物插于PcDNA厂LAG产的BamHI/EcoRI酶切位点之间。含有JEV PrME与E基因片段的重组质粒分别命名为PJME与PJE。将二者分别转化于大肠杆菌 JM109中并经 LB琼脂培养(AmPicillin,70u吵IIl,Sig-ma)筛选出阳性菌落,接种于 Znil LB培养液中,碱裂解法提取质粒。Burn-HI/ECORI酶切鉴定,再经位于载体上的’I7噬菌体启动子引物进行测序分析,以检测插人子与载体间的接合位点。扩增培养鉴定后的克隆,重复前述的鉴定步骤。再次鉴定后的质粒被调整成终浓度ling/Inl保存并用于转染实验。pJME小JE的转染与表达:不同量的重组质粒分别为pJME:10 pg/well,sugiwell,3ug/well;PJE:10u吵well,swg/well,3ug/well;同时以 10ugiwellPCDNA厂LAG乃为阴性对照。采用脂质体转染技术将重组质粒转染于HePGZ细胞。具体为:将不同量 PJME、PJE以及 PcDNA厂LAG万分别与*…脂质体混合后配制成终体积*0…**A许质体混合物,室温孵育15分钟后加人预先经无FCS的D-MEM冲洗的HepGZ细胞中,37℃3 /J\时孵育后更换新鲜含 10%FCS D-MEM培养液继续培养 48小时,收集细胞并悬浮于TE BufferhH7.5人以检测由重组质粒中插人子所编码的PrME上蛋白的表达。采用Anti-FLAG抗体系统检测分析HePGZ细胞内带有FLAG标记蛋白的JEV PrME下蛋白的表达特征。简言之,细胞裂解物经10%SDS一聚丙酸胺凝胶电泳,每种样品上样总量 20屿,之后转印于尼龙膜过夜(Transfer buffer*.1呢SDS,25mM Tis,192InM Glycine,20啪Methanol),取膜经TING-Nb伽r(50mMTispH7.5,smMEDTA,150mMNaCI,0.25阮 Geratin,0.05% NonidentP-40)室温处理 2 X 15分钟,将鼠源性 Anti-FLAG单抗与膜在 37℃反应 60分钟,TING-N b业r室温洗膜 2 x 15分·2·钟,将膜与连接辣根过氧化酶羊抗鼠IgG在37t反应60分钟,再次洗膜二X 15分钟,选用放大化学发光蛋白杂交检测系统检测结果,并经计算机软件 STORM860扫描成像。以 10Pglwell的 PJME与 PJE分别转染于 KN73与COS八细胞,采用Anti-FLAG系统进行Western blot分析,检测相关蛋白在细胞内的表达特点,方法同前。采用Anti-E特异性抗体系统检测HepGZ人OS-1细胞内 E蛋白的表达。取前述的 10卜g/well pJME*卜g/well……   
[关键词]:流行性乙型脑炎病毒;prME蛋白中蛋白;质粒构建;蛋白表达;DNA免疫
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国医科大学2002年