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高毒力苏云金杆菌菌株的筛选及cry2Ab基因的克隆

王永

  苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)是目前防效显著、应用广泛的微生物杀虫剂。深入发掘我国丰富的苏云金芽孢杆菌资源,筛选高毒力及特异性菌株,分离克隆新型高毒力的杀虫蛋白基因,对微生物杀虫剂的研制、构建高效广谱工程微生物和培育转基因抗虫植物具有重要的理论及实践意义。本研究从河北省境内44个县市采集土样500份,从中分离出苏云金芽孢杆菌25株。生物测定结果表明:WZ-2,WZ-7,WZ-4,WZ-5对多种鳞翅目害虫幼虫具有高毒力,如小菜蛾、菜青虫、棉铃虫、玉米螟、甜菜夜蛾。特别是WZ-7菌株,对棉铃虫(Helicoverpa armigera)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、玉米螟(Ostrinia furnacalis)幼虫,LC_(50)分别为3.30×10~5cells/mL、1.16×10~5cells/mL、5.21×10~6Cells/mL;WZ-9对马铃薯瓢虫有特效,LC_(50)为2.95×10~7cells/mL利用PCR-RFLP鉴定体系对WZ-7菌株进行基因型分析,鉴定结果显示该菌株含有cry1Ab、cry1Ca、cry1Ba、cry2Ab、cry1Ial基因,并且这5种基因型全部定位于质粒上。根据已知的cry2Ab基因ORF序列,设计合成了一对特异性引物,PCR扩增出cry2Ab基因全长,并直接与pUCm-T载体相连。将其连接产物转化大肠杆菌菌株DH5α,PCR-RFLP鉴定克隆转化子,得到阳性克隆pWZ2Ab。核酸序列分析及氨基酸同源性比较,该基因与已知的cry2Ab1、cry2Ab2、cry2Ab3、cry2Ab4基因的同源性分别是99.8%、99.8%、99.8%和99.5%,其编码的氨基酸在位点110、414、446、497、514与已知的4种Cry2Ab毒素蛋白发生了变化。该基因编码区为1902bps,编码633个氨基酸的晶体蛋白,分子量为70.6kDa,等电点为pI8.96,属于弱碱性蛋白。该基因序列目前已在向GeneBank登记注册,Accession Number为AY297091,并已提交国际Bt-δ-内毒素基因命名委员会命名。……   
[关键词]:苏云金芽孢杆菌;cry基因;杀虫活性;PCR-RFLP;基因克隆
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:河北农业大学2003年