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人骨髓间充质干细胞体外培养及其细胞因子表达的研究

朱光荣

  骨髓造血微环境为造血干细胞/祖细胞(HSC/HPC)提供生长发育的场所。造血微环境细胞成分主要由骨髓多能间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BM-MSC)分化产生的成纤维细胞、脂肪细胞、成骨细胞等基质细胞构成,它们通过与HSC/HPC胞体接触和分泌多种细胞因子,正负调控细胞的增殖、分化,维持骨髓正常造血。近年来,由于BM-MSC在体外成功地分离培养,并能诱导分化为骨、软骨、脂肪细胞、神经细胞等多种其他组织细胞,引起了人们对BM-MSC的广泛而深入的实验和临床应用研究。本研究主要内容共分为二个部分进行:第一部分探讨如何建立稳定的骨髓间充质干细胞的体外培养体系,骨髓间充质干细胞的有效的分离途径、鉴定、增殖活性测定。第二部分采用RT-PCR的方法检测各种造血细胞因子在骨髓间充质干细胞中的表达,以及在氢化可的松诱导下细胞因子表达的改变。在分子水平分析BM-MSC支持造血功能的实验基础。第一部分:人骨髓间充质干细胞的体外培养扩增在体内多能间充质干细胞(BM-MSC)能分化为成纤维细胞、脂肪细胞、成骨细胞等基质细胞以促进造血。但BM-MSC在骨髓中含南京医科大学硕士学位论文量极少,为了了解对BM-MSC的支持造血的功能,本研究采用间克质干细胞培养基对采自正常人和病人的骨髓分离培养BM-MSC,进行体外扩增,IL察BM-MSC的形态学,通过免疫组1匕方法鉴定 BM-MSC的表面标i乙测定其集落形成能力(CFUf),传代后细胞增殖活力有无改变。结果显示BM-MSC呈纤维母细胞样,单层贴壁生长,有明显方向性和强大的增殖能力。细胞倍增时间为46 小时,集落形成能力为正常骨髓单个核细胞(MNC)69 15000倍。体卜培养69 BM-MSC 100O均表达CD13,CD105,$表达CD34。由止匕表明B*-MSC有其自身的细胞生物学特征,是不同于造血干细胞的另一类 骨髓于细胞。体外培养能得到大量均一的B*-MSC,为进一步B*-MSC的实验研究和临床应用服务。第二部分:人骨髓间充质干细胞的细胞因子表达的研究BM.MSC分泌多种重要的造血因子支持造血‘”‘”’,’*”。本研究采用RT一PCR万法‘”’,在 m叫A水平分析N体PF传代培养的人 BM-MSC造血因子的表达,以及氢{匕考的松nydrocortison,HC)对BM-MSC表达造血细胞因子的影响”’,‘’‘。结果显示体外传代培养的正常人和白血病和淋巴瘤等某些血液病人BM-MSC均能表达SCF、Fit3-ligand、TPO、LIF、IL6。ILl 等重要的造血细胞因子,但不表达G-CSF、G*-CS厂 不同病例的BM.MSC细胞,造血细胞固子的表达无明显差别。在体外经多次传代,上述细胞因子仍能长期稳定地表达。B*-*SC经氢化考的松作用7刁 天后,可诱导G-CSF mKNKNA表达,但不诱导GM(SF的表达,细胞也未发生形态学明显改变。提示体外培养的正常人和本组血液病病人BM-MSC都具有促造血功能。在体外培乔时能长期保持其分泌细胞因子支持造血的能力。这为临床应用提供了有力的实验基础。综上结果表明,采用本实验的方法能有效分离到BM-MSC,其在体外培养及扩增时,细胞增殖活性基本保持不变。在某种物质的诱导下能够向其它成熟的组织细胞分化。正常人和不同病例骨髓间充质干细胞表达的造血细胞因子完全相同。细胞经多次传代后,细胞因子表达未发生改变。在氢化可的松诱导下,间充质干细胞可表达G-C盯。证明间充质具有很强的支持造血功能,并有望进行体外大规模扩增,支持造血千细胞移植后造血4南京医科大学硕士学位论文重建的临床实际应用。……   
[关键词]:骨髓间充质干细胞;体外培养;细胞因子;聚合酶链式反应
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:南京医科大学2003年