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缺氧诱导因子1相关肽的筛选及活性研究

张爱霞

  缺氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor 1,HIF-1)是低氧反应的关键的转录调节因子,在许多器官的O_2平衡中起着十分重要的作用。HIF-1的靶基因在血管生成、能量代谢、红细胞生成、血管舒缩功能和凋亡/增殖反应以及正常发育和肿瘤生长中起到了至关重要的作用。因此,对细胞、组织或动物体内的HIF-1活性进行精确的调控,对药物的开发和生物学研究是至关重要的。由于大分子的蛋白质是很难通过细胞膜的,因此我们通过本研究寻找一种可以调节HIF-1生物学活性的短肽,为缺血性疾病及肿瘤的治疗的新途径进行了探索性的研究。我们的工作分为以下三部分进行:一.HIF-1相关肽的筛选:以抗HIF-1α单克隆抗体(HIF-1α mAb)为配基,采用亲和免疫法从噬菌体随机12肽库中筛选与抗体特异结合的噬菌体。在筛选过程中,逐轮提高HIF-1α mAb的稀释度并增强洗脱强度。3轮筛选后,我们首先随机挑取10个克隆,提取单链DNA后测序,获得了7个序列。随后又挑取了45个克隆,经过Dot-ELISA鉴定后,对其中的22个阳性克隆测序,得到6个序列。两次测序共获得11个序列,其中重复最多的序列是G P H H Y W Y H L R L P。二.HIF-1相关肽序列的分析设计及合成:首先将筛选出的序列与HIF-1α进行同源性比对,结果发现这些序列与HIF-1α虽然不具有同源性,但丰度较高的氨基酸却非常相似,这说明我们筛选得到的表位是HIF-1α的有效表位。由于HIF-1α的降解途径主要是由于pVHL对其ODD区的识别所南京医科大学硕士学位论文导致的,并且在0*D区中与w*L作用的序列是高度保守的,所以我们据此确定了拟合成的 *F刁 相关肽的核。C序列为LAPYI。这一核。C序列的理化性质并不适合于体外的细胞实验,因此我们应用蛋白质分析软件,在核。。序列的基础上,以等电点、分子量、极性等理化性质为指标,用第一步实验得到的12肽序列分析设计了一系列全新的与*F刁相关的序列。符合实验要求的候选序列有8个,根据等屯互最接近细胞培养液的pH值,体外半衰期最长,不稳定系数和分子量最小的原则,最终确定合成肽的序列为**AP’*1**HH,其中P*为羟脯氨酸。三.HIF刁相关肽的活性及作用机制的研究:用传代培养的 PC12细胞,给予终浓度为125 U mol/L CoCI。模拟缺氧sh,同时加入不同浓度的合成肽,观察合成肽对细胞损伤指标寻酸脱氢酶(lactate dehydrogenase。LDH)、超氧化物歧化酶(superoxlde dlsmutase,SOD)和丙=醛(malondialdehyde,MDA)的影响。结果发现,合成肽N.2、2刀、20刀 P mol/L组)与对照组相比,S OD活力明显增强,且呈浓度依赖性。MDA的含量则呈下降趋势。合成肽对LDH的漏出量没有明显的影响。鉴于上述实验结果,采用免疫荧光技术,我们进一步研究了在常氧和化学缺氧(用终浓度为125以2OI几 COQZ模拟缺氧4m条件下,合成肽对PC12细胞的*Fl及其下游靶基因VEGF蛋白水平的影响。结果发现,无论是在常氧还是在化学缺氧条件下,合成肽0.2、ZO刀vmol几组)与对照组相比较,m卜1和***F的蛋白水平没有明显的差异。以上的结果说明我们设计合成的HIF刁 相关肽具有一定的生物学活性,但较弱,尚不能达到调节HIFl蛋白水平从而完全保护细胞免受缺氧的损伤。……   
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