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三株猪流行性腹泻病毒的Envelope(Small Membrane,sM)编码基因的序列测定比较

刘春艳

  本试验以3株不同来源的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV-QD、LZ、TS)为材料,提取总RNA,根据GenBank中的PEDV基因组序列自行设计合成特异性引物,以总RNA为模板,利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出了PEDV结构基因-包膜基因(envelope gene),并且连接到T载体克隆,经过鉴定后测序分析:结果3毒株的核苷酸序列同源性为99.6%-99.8%,氨基酸序列的同源性在98.7%-100%。与国外发表序列NC-003436和AF353511的核苷酸序列同源性为99.8%-100%,氨基酸序列同源性为98.7%-100%,基本相同。并且本试验对PEDV进行了传代与纯化。在病毒传代纯化过程中首次于接毒后的细胞维持液中加入了硫酸葡聚糖(Dextran Sulfate,DS)以促进病毒的致细胞病变作用。DS浓度分别为:100μg/ml、50μg/ml和25μg/ml。在病毒加入DS传代17-20代后以蚀斑挑选方法纯化病毒,如此纯化4-5次后大量增殖病毒以进行分子生物学实验。经试验证明,DS的3个浓度中以50μg/ml最适合纯化,25μg/ml次之,100μg/ml较差。加入DS后能明显的促进接毒细胞的病变,大大的缩短了收毒时间,这在本病毒的研究中尚未见报道,同时也为收毒时间长的病毒细胞传代提供了一种参考方法。对于PED的诊断,目前国内多使用ELISA、血清学等方法,而本试验所设计的一对引物可以稳定特异的扩增出E gene,对于PED的PCR诊断具有重大意义。……   
[关键词]:猪流行性腹泻病毒;包膜(小膜)基因;硫酸葡聚糖
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:中国农业科学院2003年