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海岛棉Rar1、Sgt1、Rac1、KTN1基因及中棉cab基因启动子的克隆和功能分析

李为民

  棉花是一种重要的经济作物,在国民经济中具有重要作用。当前我国棉花生产中存在两个关键问题:一是棉花黄萎病危害严重,二是棉纤维品质需进一步改良。针对以上问题,本论文从基因的角度进行了以下三部分研究:(1)海岛棉(Gossypium barbadense)防卫反应相关基因GbRar1、GbSgt1,GbRac1的克隆及转基因烟草的抗病性分析。Rar1、Sgt1、Rac1是三个R防卫反应途径的基因,功能定位于R蛋白下游与活性氧激发之间。用简并引物PCR及3’RACE等技术,从海岛棉品种7124中克隆了GbRar1、GbSgt1、GbRac1等三种基因。Southern杂交证明GbRar1、GbRac1在海岛棉基因组中都以单拷贝形式存在。Northern blot表明,三种基因经棉花黄萎病菌诱导后,mRNA表达量显著增加,暗示GbRar1、GbSgt1、GbRac1可能参与海岛棉对黄萎病菌的防卫反应。构建了植物表达载体pSgt、pRar和pRac,用根瘤农杆菌LBA4404分别转化烟草品种NC89,Southern杂交证明GbRar1、GbSgt1、GbRac1基因都已分别整合到烟草基因组中。采用离体叶片接种法,用烟草赤星病菌对转基因植株进行抗病性鉴定,以非转基因烟草为对照,结果显示转GbSgt1、GbRar1、GbRac1基因的烟草分别有5株、7株、4株抗性明显提高。据我们所知,目前尚没有Rar1和Sgt1在转基因植物中抗病性分析的报道,本实验为植物防卫反应相关蛋白在植物抗病基因工程中的应用进一步提供了实验证据。(2)海岛棉GbKTN1基因的克隆和过量表达对酵母细胞伸长的影响。KTN1是一种微管切断蛋白,已知拟南芥KTN1在纤维细胞起始伸长、持续延伸及细胞壁合成过程中起重要作用。用5’RACE/3’RACE从海岛棉7124开花后10d的纤维细胞中分离获得了GbKTN1的cDNA序列。Southern杂交证明GbKTN1在海岛棉基因组中以单拷贝形式存在。半定量RT-PCR结合Southern杂交分析表明,GbKTN1在海岛棉根、茎、叶及纤维细胞中均有表达,以纤维细胞中的表达最高,叶中最低。推测GbKTN1在厚壁组织细胞中的表达要高于其它类型的细胞,但这尚需用实验进一步证明。利用裂殖酵母系统,初步分析了GbKTN1对细胞伸长的功能,发现该基因在酵母细胞中过量表达使细胞长度增加2~3倍,部分细胞呈不规则形状,这暗示GbKTN1在海岛棉中可能具有调控纤维细胞伸长的功能。对GbKTN1与纤维细胞①8细胞壁合成和细胞伸长的关系作进一步的深入研究,揭示它与棉纤维发育的相关性,可能会为棉花纤维品质改良的基因工程提供一些有益的思路。门)中棉(Gos地iumarboreum)光诱导基因Gacab启动子的克隆及其功能研究。高等植物的捕光叶绿素a儿蛋白复合体基因(ca)是一类光诱导表达的基因。利用加接头法,从金华中棉中分离获得了Gacab编码区5’上游的调控序列1009 hp,命名为 Gacab P,与公布的其它植物 cab启动子序列比较,没有明显的同源性。将Gacab P和 197、504、779 hp的 5’端缺失体分别与 gus(md A)基因融合,构建植物表达载体。GUS组织化学分析GacabP::gus在烟草不同器官中的稳定表达,发现Gacab P驱动 gus基因在叶片及绿色幼嫩组织中表达。在暗培养的转基因烟草叶片中 Gacab P不表现活性,而光能够诱导 gus基因的表达。这些结果表明,Gacab P是一种光诱导型启动子。用基因枪轰击水稻愈伤组织,结果显示 Gacab P及三种不同长度的缺失体均可驱动 gus基因的瞬时表达,以 504 hp缺失体活性最高,197 hp、779 hp和 1009 hp的表达减弱。由此推测 Gacab基因的基本启动子存在于-197一fop,-504一197 hp间包含Gacab启动子的正调控元件,-1009一504 hp间包含负调控元件。另外,504 hp缺失体驱动gSS的瞬时表达水平明显高于3 5 S启动子,这一现象值得进一步探讨。根据目前文献报道,本文获得的序列是从棉属植物中分离得到的第一个 cab 5’上游调控序列,这为植物基因工程与光调控的研究提供了可用的元件。……   
[关键词]:棉花;植物防卫反应相关基因;剑蛋白;光诱导启动子
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国农业科学院2003年