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大麦黄矮病毒GAV基因组全序列分析及运动蛋白基因介导的抗病毒小麦的研究

晋治波

  本研究运用反转录PCR与5’和3’RACE的方法,首次测定了在中国分离得到由麦长管蚜和麦二叉蚜传播的大麦黄矮病毒GAV的基因组核苷酸全序列(GenBank登录号:AY220739),并与其它相关病毒(分离物)进行了比较。另外,通过RT-PCR、克隆和序列测定,获取大麦黄矮病毒GAV分离物的运动蛋白基因(MP)并经过缺失突变构建了植物表达载体。采用基因枪介导法转化小麦品种扬麦158,初步研究了运动基因介导的抗病性。根据已报道大麦黄矮病毒MAV-PS1的基因组序列和大麦黄矮病毒GAV的部分序列设计引物,通过RT-PCR获得GAV的ORF1、ORF2、以及ORF1-ORF6各基因之间的序列片段。经过克隆、序列测定和拼接得到GAV基因组RNA大部分核苷酸序列。采用已测定的ORF6上游一段序列和PAV-aus的3’最末端保守序列作为特异引物进行RT-PCR,获得GAVORF6下游大部分序列。最后经过5’RACE和3’末端寡核苷酸锚定PCR完成基因组RNA全序列测定。序列分析表明,该病毒分离物的RNA基因组由5685个核苷酸组成。分子量大小与BYDV-PAV澳大利亚分离物PAV-aus接近。它与MAV美国MAV-PS1分离物基因组序列同源性最高,全基因组为90.4%。基因组所含有的六个开放阅读框架,除ORF5和ORF6核苷酸序列同源性分别为87.4%和72.0%外,其他基因核苷酸序列同源性均大于90%。各基因编码的蛋白氨基酸顺序同源性除P6蛋白和通读蛋白(RTP)分别为67.4%和87.4%,其它均大于90%。其中外壳蛋白(CP)为95.5%。根据GAV和BYDV-MAV的相似性,GAV应是一种与BYDV-MAV类似的病毒,这是有关BYDV-MAV或相似病毒基因组全长序列的首次报道。通过RT-PCR、克隆和序列测定,获取大麦黄矮病毒GAV分离物的运动蛋白基因。同源性比较显示,它与MAV-PS1分离物运动蛋白基因的核苷酸序列及氨基酸顺序同源性分别为97.8%和96.8%,而与PAV-aus的同源性仅为78.3%和70.1%。把该片段克隆到大肠杆菌表达质粒pGEX-4T1上,转化JM109后经IPTG诱导得到强烈表达的目的蛋白。采用谷胱苷肽亲和层析柱纯化表达产物,纯化后的融合表达蛋白经SDS-PAGE电泳检测纯度大于90%。将纯化的表达产物免疫家兔制备抗血清。运用制备的抗血清检测被GAV侵染的燕麦叶片,结果表明在发病燕麦体内含有与抗血清发生特异性作用的22KD蛋白,而对照健康燕麦呈阴性反应。由以上证据可知,抗血中囚状业科学院博士学位论文一清可以用于转基因植物的检测和运动蛋白的体内定位研究。分别把运动蛋白(MP)全长基回片段、缺失 N端门个氨基酸的基因片段(So)。缺夫C端19个氨基酸的基因片段臼Q)和缺失两端36个氨基酸的基回片段门3Q入克隆到表达质粕pEmu-mesN上,构建植物表达质粒pEmuMP、pEmu5Q、pEmu3Q和 pEmu臼Q。采用基因枪介导法分牙叫苔三种质粒 pEmuMP。pEmu5Q、pEmu3Q导入小麦品种扬麦158。经草丁膀抗性筛选、PCR。Southern杂交等一系列分子鉴定,分别获得导入 pEmuMP的转基因 TO代小麦 14株,转化率为 0.53%;导入 pEmu3Q的转基因小麦为3株,转化率为0.ZI%;而导入pEmu5Q的愈伤组织没有获得转基因植株。继续对部分盆栽的*代植株进行分子检测和接种病毒抗病性筛选。转入全长运动蛋白基因的植株表现为发病较快且症状较重,发病时间比对照提前约一周左右。导入缺失突变基因的植株发病延迟,症状相对较轻。……   
[关键词]:大麦黄矮病毒;GAV;基因组全序列;运动蛋白;基因枪
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国农业科学院2003年