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鸡贫血病毒DNA疫苗的研究

张恒

  鸡贫血病毒(chicken anemia virus,CAV)是鸡传染性贫血病(chicken infectiousanemia,CIA)的病原体。1979年在日本首先报道该病并分离到病毒,我国于1992年在发病鸡群中分离到该病毒。CAV主要侵害鸡的骨髓造血组织和中枢免疫器官,引起再生障碍性贫血和免疫抑制,同时,CAV感染还能增加病鸡对其它传染性疾病的易感性并降低疫苗的免疫效果,从而给养鸡业造成严重的经济损失。CAV的基因组是一个单链环形DNA分子,长度为2319个核苷酸,包括部分重叠或完全重叠的三个开放读码框,共编码VP1、VP2、VP3三种蛋白质。VP1是CAV的衣壳蛋白,是CAV的保护性抗原,VP2是VP1的辅助蛋白,VP3是CAV的致病蛋白,也称凋亡素,vp3基因完全重叠于vp2基因内部。体外培养CAV时,无论在鸡胚还是在培养细胞中,获得高滴度的CAV都很困难,而且致弱病毒的致病性很难,因此灭活疫苗和弱毒疫苗的生产和应用受到限制;同时,由于CAV基因结构的特殊性,基因工程疫苗的研制也有很大困难,目前还没有投入生产的报道。DNA疫苗作为最近几年发展起来的第三代疫苗具有诸多优点。DNA疫苗能够诱导全方位且持久的免疫反应,在预防病毒和胞内菌感染方面更是具有独特的优势,因此DNA疫苗的研究和发展为鸡传染性贫血病的预防开辟了一条新的道路。本研究以实验室克隆保存的野生CAV基因组pUC18-CAV为模板,通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)的方法在CAV的DNA序列中制造定点突变,得到载有CAV突变体的pUC18-CAVm。对此突变体的DNA序列进行测序并与原始序列用BLAST进行比较可以发现发生了三个位点的突变:T(466)变为C,C(472)变为A,T(475)变为G。vp3基因位于465~830位碱基,因此T(466)变为C导致位于465~467位碱基的vp3基因的起始密码子ATG(在mRNA是AUG)突变为ACG而失去翻译起始位点的功能,C(472)和T(475)的突变使470~475位的碱基序列由CGCTCT变为CGATCG而成为Pvu Ⅰ的识别序列,这个酶切位点在CAV突变体的构建过程中发挥了重要的作用。vp2基因位于359~1009位碱基,突变引起的vp2基因密码子的变化是:464~466位的AAT变为AAC,470~472位的CGC变为CGA,473~475位的TCT变为TCG。由于密码子的简并性,这三个位点的变化均未引起VP2蛋白的氨基酸残基序列的变化,因此CAV突变体的抗原特异性不会发生变化。用EcoR Ⅰ将pUC18-CAVm的CAVm序列切下并连接到用EcoR Ⅰ处理的原核表达质粒pET-30b(+)上,转化感受态宿主菌DE3即得到DE3-pET-CAVm,通过酶切的方法筛选出正向克隆,利用IPTG诱导表达并进行SDS-PAGE,我们可以发现对照菌株DE3-pET-CAV表达了VP1(51.6kD)、VP2(24.0kD)和VP3(13.6kD),而DE3-pET-CAVm鸡贫血病毒DNA &苗的研究只表达了VP和VPZ,并没有表达 VP3,这说明CAV。中的点突变抑制了Vp3基因的表达,达到了预期的目的。在CAV的DNA序列中有一个非转录区,该区具有类似启动子的作用。启动子区中有一个区域含有四个或五个几乎完全相同的21个碱基的同向重复序列则rectrepeat,DR),在这些同向重复序列中有一个12碱基的插入序列,单一的重复序列或插入序列均能与鸡的T细胞核中的转录因子结合,这表明重复序列和插入序列是启动子区内具有增强子活性的成分。由于CAV的DNA序列中含有真核启动子和增强子,所以可以用pUC-CAVrn作为DNA疫苗直接进行动物免疫实验。由实验结果可以看出,用PUCIS七AVm对SPF鸡进行免疫注射可以降低 SPF鸡对 CAV的易感性,具有一定的免疫保护作用,加强注射可以提高这种保护作用;同时可以看到这种免疫作用仍然有限,距离疫苗的研制成功和商品化生产还有很大距离。由于CAV对养鸡业具有严重危害,所以引起了人们的重视。预防CAV传染的主要途径是研制疫苗进行预防接种。目前对CAV疫苗的研究包括弱毒苗和基因工程疫苗,尚未见到研制DNA疫苗的报道。本研究成功构建了CAV的突变体,原核诱导表达实验说明突变抑制了致病蛋白VP3的生成,可以使突变病毒失去致病力,初步动物实验证明pUC-CAVm具有一定的免疫保护作用。这说明利用DNA疫苗预防鸡贫血病毒的传染是可行的,并为鸡贫血病毒DNA疫苗的研制成功和商品化生产奠定了坚实的基础。……   
[关键词]:鸡贫血病毒(CAV);DNA疫苗;聚合酶链式反应(PCR);定点突变
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:山东师范大学2003年