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滇黑两省南瓜病毒病病原鉴定及其外壳蛋白基因克隆

杨国慧

  黑龙江和云南两省分别是我国正季和反季节南瓜生产的大省,近年来随着栽培面积的不断扩大,病毒病害也日益加重,引起严重的产质和质量损失。本研究通过从云南、黑龙江两省采集南瓜病样,确定引起两省南瓜病毒病害的主要病毒病原,分离克隆主要病毒病原的外壳蛋白基因,并对两省的部分南瓜材料进行了抗主要病毒病原的初步筛选,为南瓜的抗病毒育种和病毒病的有效防控奠定基础。本项研究采集了南瓜病毒病样品191份,其中黑龙江省149份,云南省42份,采样涉及了两省南瓜生产的主要区域。应用电子显微镜负染法和超薄切片法观察病原粒体形态及细胞病理学特征;利用酶联免疫吸附测定(ELISA)法中的双抗体夹心ELISA(DAS-EILSA)、间接ELISA(I-ELISA)、三抗体夹心ELISA(TAS-ELISA)以及反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、免疫捕捉PCR(IC-PCR)方法鉴定了采集样品中的病毒种类;对被确定为南瓜主要病毒病原的外壳蛋白(CP)基因进行了PCR扩增,克隆到pGEM-T载体并进行测序;应用摩擦接种法和浸根接种法对云南、黑龙江省部分南瓜品系、品种进行了抗性筛选。研究结果表明,云南省南瓜病毒种类有番木瓜环斑病毒西瓜株系(PRSV-W)、黄瓜花叶病毒(CMV)、小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV)、粉虱传双生病毒(WTG),四种病毒病原所占比例分别为52.4%、38.1%、11.9%、2.4%。黑龙江省病毒种类有CMV、西瓜花叶病毒(WMV),其所占比例为24.2%、17.5%。另外两省的病毒样品在电镜下均观察到了明显的番茄斑萎病毒属(Tospovirus)病毒。初步确定云南省南瓜主要病毒病原为PRSV-W和CMV,黑龙江省南瓜主要病毒病原为CMV、WMV,自然条件下还常常发生复合侵染。对PRSV-W、WMV侵染的南瓜病叶的细胞病理学观察结果表明,在感病细胞中有大量的风轮状、片层状和条带状内含体,线状病毒粒体呈束状或散布在细胞质中,具有典型的马铃薯Y病毒属(Potyvirus)侵染寄主引起的细胞病理特征。在CMV侵染的南瓜细胞中,病毒粒体在细胞质中聚集于似球形的膜内。对南瓜病毒病的细胞病理研究国内尚未见同类报道。对PRSV-W云南南瓜五个分离物、WMV黑龙江南瓜分离物、CMV云南、黑龙江南瓜分离物的外壳蛋白基因进行了序列分析。结果表明,PRSV蒙自分离物(PRSV-MZ)和石屏分离物(PRSV-SP)CP基因核苷酸序列全长873bp,编码291个氨基酸,PRSV峨山分离物(PRSV-ES)、版纳分离物(PRSV-BN)和宾川分离物(PRSV-BC)全长867bp,编码289个氨基酸。PRSV蒙自分离物和石屏分离物的同源性最高,二者的核苷酸和氨基酸序列同源性分别达到98.7%和98.9%,酶切位点分析和序列分析结果一致。对PRSV云南南瓜五个分离物和国外17个PRSV分离物、2个国内PRSV分离物的序列比较初步表明,PRSV CP基因的序列在番木瓜环斑病毒西瓜株系(PRSV-W)和番木瓜环斑病毒番木瓜株系(PRSV-P)两个株系中差别不是很大,和地理位置有一定的关系。WMV黑龙江南瓜分离物(WMV-HLJ)CP基因全长852bp,编码284个氨基酸,序列分析和酶一切位点分析都表明,WMV黑龙江南瓜分离物和山西分离物同源性高于和郑州分离物的同源性。CMV云南南瓜分离物(CMV-YN)和黑龙江南瓜分离物(CMV-HLJ)CP基因全长均的7hp,编码2 9个氨基酸。两个分离物的核音酸和氨基酸同源性分别达到96.8%和 97.4%,和国内外 CMV亚组 1、亚组*的不同分离物的比较表明这两个分离物和亚组1分离物的核昔酸同源性在89%以上,氨基酸同源性在93%以上,和亚组*分离物的核苦酸同源性在69%以下,氨基酸序列同源性在74%以下,确定CMV云南、黑龙江两个南瓜分离物属于亚组厂对云南省的门 份南瓜材料进行了抗 PRSV-W、CMV的筛选、对黑龙江省的 20份材料进行了抗 CMV、WMV的筛选,结果表明云南省的]1份材料中对 PRSV-W表现为抗病的1份、中抗的5份、感病的1份、高感的4份。对CMV只有1份表现为中抗,6份表现为感病,4份表现为高感。黑龙江省的20份材料中只有2份对WMV表现为中抗,其余表现为不同程度的感病,对CMV表现为高抗的有2份、抗病的3份、中抗的7份、感病的7份、高感的1份。本研究通过系统鉴定初步明确了云南、黑龙江两省南瓜的主要病毒病原,首次对PRSV五个云南分离物、WMV黑龙江分离物和CMV黑龙江、云南分离物进行了CP基因的扩增、克隆和测序,以及对两省的部分南瓜品种、品系进行了抗主要毒源的初步筛选,研究结果可用于南瓜的抗病毒育种和病毒病的有效防控,为南瓜产业的持续发展提供技术和产品支持。……   
[关键词]:南瓜;病毒病原;外壳蛋白基因;抗源材料
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:东北农业大学2003年