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三种基因治疗靶细胞的分离与体外培养

陈勇

  基因治疗(gene therapy)是现代医学和分子生物学迅速发展和结合的产物,从基因水平上对遗传病和肿瘤进行治疗已成为医学发展的必然趋势和人类健康的迫切需求。目前基因治疗面临着三个方面的主要问题:1、安全的载体。2、高效的转染方法。3、适宜的靶细胞。夏家辉院士于1981年在对两个正常人家系的研究分析中发现一种罕见的双随体小染色体(bisatellite microchromosome BM)不仅能独立于46条染色体之外稳定遗传,而且对人体无任何危害。在此基础上我们利用BM特异性片段构建了D、G组染色体短臂导向的基因打靶载体—人源基因载体,并成功地利用该载体将外源基因定点导入基因组中D、G组染色体短臂的安全靶位点,外源基因的有效、稳定表达,证明了人源基因载体可作为一种安全、理想的基因治疗载体。该基因治疗载体成功地避免了病毒载体面临的一系列安全性的问题。间接体内法(ex vivo),是目前较常使用的一种基因治疗方法,该方法在体外将基因导入从人体取出培养的靶细胞,再将这种基因修饰过的细胞输回体内进行表达,达到治疗目的。此法与直接体内疗法相比,其突出的优点是带有目的基因的细胞可在体外进行筛选和富集,并且可以在体内较长期发挥作用,从而保证了基因治疗效果;同时,宿主细胞往往是来自于人体自身的组织,一般不会被自身的免疫系统所排斥,不会发生副作用和毒性反应。结合我室的人源基因载体优势和特点,因此我们选用了自体体细胞间接体内转导的基因治疗技术思路。为此我们需要选择适宜的靶细胞,并在体外大量培养以供下一步基因转染、表达等研究使用。本研究选择了皮肤成纤维细胞、角质形成细胞和成肌细胞作为基因治疗靶细胞。围绕这三种靶细胞的分离与体外培养,我们进行了以下的研究和探索。第一部分 成人皮肤成纤维细胞的分离和体外培养的安全性实验研究采用胶原酶、透明质酸酶、胰酶等联合对取自成人的2~3cm~2小面积皮肤消化,获取皮肤成纤维细胞在体外大量培养。并对培养的细胞进行细胞形态学观察、免疫组织化学鉴定、生长曲线测定、染色体核型分析、软琼脂试验、裸鼠致瘤试验、内毒素试验、支原体检测、病毒因子检测、细菌、真菌检测和异常毒性试验等相关安全性检测。硕士学位论文三种基因治疗靶细胞的分离与体外培养实验结果显示该方法可获取较多的高纯度成纤维细胞,且在体外可稳定迅速的大量扩增,同时各项安全性检测指标均达到实验要求。从而证明该方法所获取的大量皮肤成纤维细胞可作为一种安全、可靠的靶细胞用于自体皮肤成纤维细胞基因治疗研究。第二部分 成人皮肤角质形成细胞的分离与原代无血清培养采用两步消化法对取自成人的皮肤进行消化,从剥离的皮肤表皮层中获取角质形成细胞在体外无血清培养基中培养,并对培养的细胞进行细胞形态学观察、免疫组织化学。透射电镜鉴定及生长曲线的绘制与分析。结果显示该方法可获取较多高纯度的角质形成细胞,且在体外可快速稳定增殖。从而证实该方法所获取的表皮角质形成细胞可为烧伤治疗学、皮肤病发病机理及基因治疗的研究提供一种充足、可靠的实验靶细胞。第三部分 成人成肌细胞的初步分离与体外培养首先用两步消化法对取自成人骨骼肌组织进行消化获取相对较纯的成肌细胞,通过差速贴壁法进行进一步的纯化,并对获取的成肌细胞进行细胞形态学观察、兔疫组织化学、透射电镜鉴定及生长曲线的绘制与分析。结果显示该方法可获取较多高纯度的成肌细胞,且在体外可快速稳定增殖。该方法所获取的成肌细胞可为Duchenne肌营养不良的治疗、血友病、血栓闭塞性脉管炎U格氏病人 心肌梗死和慢性心衰的基因治疗的研究提供一种充足、可靠的实验靶细胞。上述研究结果表明,皮肤成纤维细胞、皮肤角质形成细胞、成肌细胞三种细胞均可成功从成人组织中分离获取,并可在体外大量、安全、稳定培养,可作为理想的基因治疗靶细胞。……   
[关键词]:基因治疗;靶细胞;皮肤成纤维细胞;皮肤角质形成细胞;成肌细胞;分离;体外培养
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:中南大学2003年
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