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人类睾丸生殖细胞凋亡相关新基因TSARG2及小鼠同源基因SRG2的分子克隆及功能的初步研究

刘上峰

  睾丸生殖细胞的凋亡是一个由多基因参与的复杂过程。目前有关睾丸生殖细胞凋亡的研究尚处于起步阶段,迄今为止,尚未克隆出特异性的睾丸生殖细胞凋亡基因。而克隆新的特异性的睾丸凋亡相关基因是进一步了解生殖细胞凋亡机制和生物学过程的关键所在,对阐明精子发生的生理、病理具有重要意义。在前期的研究工作中,本室姜宏等通过建立小鼠隐睾模型,运用抑制消减杂交法(Suppression subtractive hybridization,SSH)克隆出24个小鼠睾丸生精细胞凋亡相关基因的EST,并在GenBank中登录。本研究利用巢式PCR技术和人类基因组草图搜索法,从上述EST出发,于2000年6月成功地克隆了人类TSARG2基因及小鼠同源基因SRG2,并对其功能进行了初步研究。本研究分为三个部分,其主要实验方法及实验结果如下:第一章TSARG2基因的克隆与序列分析从已获得的在隐睾和正常睾丸对照中表达量有明显差异的EST片段(BE644542)入手,设计了基因特异性引物和载体特异性引物进行巢式PCR扩增,结合人类基因组草图搜索法,从睾丸cDNA文库中快速分离出人类睾丸凋亡相关基因的5′末端而获得全长cDNA,GenBank登录号为AY040204,同时应用生物信息学的方法克隆了该基因在小鼠中的同源基因,GenBank登录号为AF395083。TSARG2基因的cDNA全长为1233bp,包含6个外显子,基因组跨越115kb,编码由305个氨基酸组成的、分子量为34751的蛋白质,与已知蛋白质无明显同源性,其最大可能是一种核蛋白。在该基因-277到+163处,有一个CpG岛,其GC含量为61.6%。在CpG岛中-191到+16处,预测出一个 205 hp的启动子。Northern杂交表明该基因在己检测组织中只在睾丸内有高表达。查询最新的人类基因组工作草图,该基因定位在染色体4q34.134.2。第二章fSARQ基因功能的初步研究我们对已经收集的不明原因的特发性无精症和严重少精症、隐睾症等患者及家系共122例进行上述基因的突变分祈,未找到该基因的突变。提示该基因在机体内发挥作用可能主要是通过表达的上调或下调而实现的。利用PCR方法从人类睾丸CD*文库分离出该基因完整阅读框CDNA,用非同位素地高辛标记的阅读框CD帆片段做探针与人类睾丸组织进行原位杂交,观察删RQ在生殖腺中的转录表达及其可能的功能作用。发现y舰在人类翠丸的各级生精细胞有较强转录表达,均发现有紫褐色的强杂交信号,提示该基因发挥作用有可能是通过在精子生成不同阶段的差异表达而实现的。为了进一步研究TsRQ基因编码产物的表达特征,通过构建增强型绿色荧光蛋白和 TsRQ基因的真核表达质粒DEGFP个/TSARQ,脂质体介导转染COS 7细胞株,考察7’sRQ基因编码蛋白的亚细胞定位,发现7sRQ融合蛋臼存在于胞核,与生物信息学预测结果一致。将构建的IsRQ原核表达质粒 PGEX-KG/IsRQ不 DGEX-4T-2/ fSARQ,转化大肠杆菌BLZI(DE3),IPTG诱导后特异高效表达,在DGEX-KG/7AIRQ和PGEX-4T-2/7N砒中表达蛋白分别占菌体总蛋白的26%和23%,表达V的融合蛋白以包涵体的形式存在。将表达产物破包涵体后经GlutathinoneSepharose 4B柱亲和层析分离,SDS-PAGE显示纯化的蛋白质为一分子量 60kD的单一蛋白带。我们将 TSARGZ基因与真核表达载体 pCDNA3*-)连接后转染人类乳腺癌MCFJ细胞,结果表明该基因能显著促进MCFJ细胞的生长。第三章SRQ基因的分子克隆、序列分析及其在小鼠隐睾中的表达特征从已获得的在隐睾和正常睾丸对照中表达量有明显差异的EST片段①E644542)入手,利用网上生物信息学克隆了该基因全长,GenBank登录号为AF395083。从小鼠睾丸CDV文库中分离出该基因完整阅读框CDNA,^;Hu-基因的CDNA全长为1088 hp,包含6个外显于,基因组跨越9.4 kb,编码由 295个氨基酸组成、分子量为 33 579、等电点为 9.64的蛋白质,与人类同源基因TNRQ相似性为78讯 而与其他已知蛋白质无明显同源性。多组织Northern杂交结果表明该基因只在睾丸中有高表达,多组织RT干CR结果与多组织Northern杂交结果一致。分别收集出生前小鼠胚胎与出生后7大、14天、21大、35天、49大、280天及隐睾14天小鼠宰丸,Northern杂交结果表明.-ti*u-基因在21天小鼠睾丸内开始表达,以后表达水平趋于稳定。同时将21大、35天、49大、280天小鼠睾丸进行组织石蜡切片,结果表明小鼠翠丸在第21天可见精子细胞,到第35天,精子生成的最后阶段开始发生,部分牛精小管中可见少量成熟的精于。第49天,小鼠已进入性成熟期,生精小管中可见大量成熟的精子,与第280天小鼠翠丸在形态上己无显著区别。上述结果证明该基因与生精过程紧密相关。Sou化e*杂VI交结果证明在隐睾中无.-nvs基因的丢失或重排,但其CPG岛有甲基化现象。应用新型的分子信标检测该基因在不同时期隐睾中的mRNA表?……   
[关键词]:基因克隆;辜丸;凋亡;分子信标;功能研究
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中南大学2003年