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人大肠癌组织蛋白质组二维凝胶电泳技术的建立及应用

陈远光

  第一部分:人大肠癌组织二维凝胶电泳技术的建立目的 应用二维凝胶电泳技术研究人大肠癌组织的蛋白质组比研究细胞系或动物的蛋白质组更为重要,但是目前国外应用二维凝胶电泳技术研究人大肠癌组织的报道较少,国内尚无报告。本部分旨在建立分辨率高、重复性好的大肠癌组织二维凝胶电泳实验技术,为进一步研究大肠癌组织的蛋白质组提供基础。方法 样品的处理中比较分析组织和裂解液的不同体积比例关系、不同的裂解液(添加和不添加2M硫脲、2%TritonX-100)、不同的蛋白上样量(200μg、400μg、600μg)所产生的结果;第一向电泳采用固相pH梯度等电聚胶,并比较确定时间-电压程序;在第二向电泳中采用垂直的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术。对各程序进行了比较分析后,采用优化的程序进行二维电泳,并用ImageMaster 2D Elite专业软件分析优化程序后获得的图谱,进行图象质量分析。结果 在组织和裂解液的体积比例关系以1:8的比例较为合适;添加2M硫脲、2%TritonX-100两种成份的裂解液所产生的2-DE斑点数要比不含该两种成份的裂解液所产生的斑点数要多;蛋白上样量为400μg时图象质量最佳;等电聚胶时间电压程序30V16hr、500V1hr、1000V1hr、3500V1hr、8000V6hr共53480Vhr水平拖迹现象大大减少。应用ImageMaster 2D Elite专业分析软件对优化程序后3次实验获得的二维电泳图谱进行初步分析,总蛋白质斑点平均数1086±64个,蛋白质位置在IEF方向平均偏差为1.98±0.39mm,SDS-PAGE方向为1.81±0.26mm,蛋白质表达量相对标准差为7.67%±2.75%;对不同丰度蛋白质的代表点的表达量、峰高、面积和分子量等参数进行分析处理,显示出良好的可比性。结论 对人大肠癌组织第一向电泳采用固相pH梯度等电聚胶,第二向电泳中采用垂直SDS-PAGE电泳技术,通过调整组织和裂解液的体积比例,裂解液中增加添加2M硫脲和2%TritonX-100,蛋白上样量为400μg,优化等电聚胶时间电压程序等可以成功地获得分辨率高、重复性好的二维电泳图谱,能够用于蛋白质组研究。……   
[关键词]:大肠癌;蛋白质组;二维凝胶电泳;固相pH梯度
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中南大学2003年