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HAL1和merB基因增强转基因植物耐盐和抗汞能力研究

田吉林

  随着蔬菜设施栽培的发展,土壤次生盐渍化日益突出,已严重影响到设施栽培的经济效益。利用植物对盐害耐性的差异,充分挖掘植物适应盐害的潜力,提高蔬菜的耐盐能力是次生盐害防治的途径之一。番茄是耐盐性中等的蔬菜,也是设施栽培的主要蔬菜品种,通过基因工程提高番茄的耐盐性不仅具有重要的现实意义,也具有实际可行性。HAL1基因最早是从啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中分离的可能与K~+离子吸收、转运调节有关的基因。已有的转基因植物耐盐检测表明,转HAL1基因植株的耐盐性得到不同程度的提高,但HAL1基因的确切功能有待进一步研究证实。本研究通过农杆菌介导把HAL1转入番茄栽培品种早粉8号,分子检测得到转基因植株。研究了外源HAL1基因对番茄耐盐性的影响,探讨了转HAL1基因番茄的耐盐机理和HAL1基因的可能功能。主要结果如下:(1)以番茄子叶和下胚轴为外植体,以愈伤组织诱导、不定芽分化及植株再生情况为指标,研究得出番茄早粉8号基因转化的受体系统为:外植体为子叶,培养基为BA2.0mg/L+IAA0.2mg/L+MS基本培养基。(2)以外植体的生长,农杆菌的增殖,不定芽的分化和成苗为指标,筛选出了合适的转化条件,建立了高效的农杆菌介导的番茄遗传转化系统。分别为农杆菌稀释10倍,浸染5分钟,共培养2天。(3)通过农杆菌介导把HAL1基因转入番茄栽培品种早粉8号,PCR和Southern Blot检测得到转基因植株,转化率达到4.5%。转基因植株经繁殖得到了T1代转基因番茄种子。(4)转基因植株Southern杂交显示出单一的杂交带,表明外源HAL1基因在番茄染色体上的整合为单拷贝插入。卡那霉素抗性检测表明,T1代转基因种子抗性与非抗性比例为3.29:1,基本符合3:1的孟德尔遗传分离方式,也表明外源基因在番茄染色体上为单位点插入。而且外源HAL1基因已遗传到后代。(5)用T1代转基因种子在盐胁迫下进行发芽实验,在无NaC胁迫下,对照种子和转基因种子的发芽率为87-89%。在50、100、150、200mM的NaC1胁迫下,转基因种子的发芽率分别为76%,59%,43%、6%。而对照种子在100mM的NaC1胁迫下发芽率只有 11刀%,在 150mM的 NaCI胁迫下的发芽率为零。转基因种子的发芽指数也得到提高,表明盐胁迫对转基因番茄发芽的延迟作用降低,一般比对照提早出芽12天。因此,转HALI基因显著提高了番茄苗期的耐盐性。u)从盐胁迫下细胞膜透性、根冠比和叶绿素含量的变化来看,转基因番茄的电解质相对外渗率小于对照,细胞膜稳定性好,根冠比和叶绿素含量大于对照,表明NaCI胁迫对转基因番茄细胞的伤害小,对根系和叶片的生长抑制作用要小于对照。进一步证实了转HALI基因番茄的耐盐性得到提高。(7)转基因番茄在盐胁迫 3天后液泡膜和质膜 H-ATPase活性比对照有明显提高,这有利于根系对K’的选择吸收和运输,降低Na”的吸收,促进根细胞中的Na’在液泡中积累,减少根细胞质中的Na’向地上部运输,提高K’/Na”。沾)从盐胁迫下地上部,地下部K”,Na”的积累特点看,相比对照,转基因番茄根系、茎杆和叶片的K‘/Na‘都得到提高。而转基因植株Na“的净累积速率比对照的Na“的净累积速率低,可把吸收的Na“尽量多的分配在根系,而把吸收的K’更多的累积在地上部,保持了地上部较高的的K’/Na’。同时,转基因根系的S。地增大,叶的RSM。减小,说明其对K‘/Na”离子的选择吸收和运输能力加强。不但选择吸收K‘Ma‘,而且表现出整株水平上的有利于耐盐的K“/Na”区域化分配。因此,转HAL 基因番茄的耐盐机理在于根系对K’、Na”的选择吸收,和 K”、Na‘在根、茎、叶等整株水平上的区域化分配。(9)在无NaCI胁迫时,不但转基因番茄的生长及产量与对照无明显差异,而且转基因番茄的表型如叶片形状、颜色,开花节位等没有变化。说明外源耐盐基因的转入对番茄其他性状无明显影响。(10)转基因番茄的不同生育期的耐盐性实验表明,盐胁迫不同程度抑制了番茄的生长发育,降低了产量。但相比对照,转基因番茄的生长和产量都得到了提高。对照番茄100mMNaCI 时已表现出明显的盐害症状,产量比正常产量降低40.5%。1501llMNICI时,产量只有正常产量的9.9%。到200 IMNICI时,植株完全死亡。而转基因番茄在 150 n1MNaC!时无黄化叶片,产量是对照的 5.8倍,是无盐胁迫产量的 59.4%。在200InMNaCI胁迫下产量仍达到无盐胁迫产量的23.4%。说明盐胁迫对苗期番茄的生长抑制作用十分明显,苗期是番茄盐害的敏感期。同时也表明转基因番茄不同时期的耐盐性得到了提高。预示了HALI基因在蔬菜耐盐育种上的巨大潜力。(11)HALI基因的功能可能是增强 K’Ma”的选择吸收,降低细胞 Na‘的毒害,调节细胞K‘/Na十b例,从而实现在细胞水平和整株水平的有利于耐盐的区域化分配。……   
[关键词]:耐盐能力;盐胁迫;地上部;农杆菌介导;液泡膜质子泵;细胞结构;基因增强
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:浙江大学2003年