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轮状病毒VP7基因表达载体的构建及其向胡萝卜中的转化研究

杨迎伍

  本实验以轮状病毒的VP7为目的基因,构建了VP7基因的表达载体和VP7-CTB融合表达载体;以胡萝卜为受体材料,建立并优化了胡萝卜的转化体系,获得了能正常转录VP7基因的转基因胡萝卜植株。设计具有NdeI和SacI单限制性酶切位点的VP7基因引物,通过PCR扩增出VP7基因并经测序验证。利用VP7基因和质粒pBI121上相同的单克隆位点,将VP7基因定向克隆到植物表达载体pBI121上,构建了pBI121VP7表达载体。在pBI121VP7表达载体成功构建的基础上,利用质粒pBI121VP7和质粒pUC19CTB上相同的NdeI和XbaI单限制性酶切位点,构建了pBI121CTBVP7融合表达载体。PCR和限制性内切酶鉴定重组质粒与实际相符。并将重组表达质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,获得转基因工程菌。以胡萝卜品种“改良黑田”为受体材料,以胡萝卜幼苗的下胚轴为外植体,建立了农杆菌介导法的胡萝卜转化体系,并对其中的种子消毒、激素水平、外植体的苗龄、选择压、共培养时间等关键步骤的条件进行了优化。结果表明:①种子的最佳杀菌条件为1%AgNO_3浸泡15min;②2,4-D对愈伤组织形成有显著的促进作用,其最佳浓度为0.1mg/L,而KT对胡萝卜愈伤组织的分化影响不明显;③种子发芽后6~7天的幼苗下胚轴最适于作为转化的外植体;④Kan浓度为100mg/L时可完全抑制愈伤组织(未用农杆菌侵染)的形成;⑤Cb浓度达到500mg/L时可完全抑制农杆菌的生长,不会出现后期感染现象;⑥28℃,避光培养3天为最佳共培养条件;⑦农杆菌稀释液倍数和侵染时间对转化没显著影响;⑧胡萝卜转化不需要附加酚类物质(AS)。通过优化的转化体系,将VP7和CTB-VP7基因导入胡萝卜中,获得了阳性株。经PCR验证,外源基因已整合进胡萝卜基因组中。经RT-PCR检测证明,外源基因已在转基因胡萝卜植株中进行转录。……   
[关键词]:转基因胡萝卜;轮状病毒;VP7基因;转化体系;农杆菌
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:西南农业大学2003年