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白纹伊蚊卵滞育与登革Ⅱ型病毒传播关系的研究

郭晓霞

  登革热(Dengue fever,DF)/登革出血热(Dengue haemorrhagic fever,DHF)是重要的虫媒病毒病之一,其病原体登革病毒为黄病毒属(Flavivirus)具包膜的单股正链RNA病毒,主要由埃及伊蚊(Aedes aegypti)和白纹伊蚊(Ae.albopictus)传播,广泛流行于全球热带和亚热带地区。诸多的实验室和野外实验均已证实在自然界存在着白纹伊蚊经卵传递登革病毒的现象,而滞育卵是白纹伊蚊实现远距离扩散的主要途径之一。登革病毒能否在感染白纹伊蚊滞育卵内存活,并随着滞育卵通过交通运输、旧轮胎贸易等人类活动扩散到世界许多国家和地区?是一个值得关注的问题,目前尚未见研究报道。本研究以白纹伊蚊广州株为研究对象,经口感染大剂量登革Ⅱ型病毒(Dengue 2 virus,DEN-2)后,收集3个生殖营养周环产的卵,一部分在实验室条件下模拟冬季相对低温、短光照及干燥的自然环境条件(4℃、75%RH、L/D=8/16),诱导滞育;另一部分采用实验室常规保存条件,在常温条件下给以干燥处理(25℃、75%RH、L/D=14/10)。首先利用半套式PCR、C6/36细胞培养分离病毒等方法检测和分离卵内病毒;进一步用核酸杂交的方法监测卵内病毒RNA的合成,以期确证登革Ⅱ型病毒能否在白纹伊蚊滞育卵内存活并有可能增殖,探讨滞育卵代谢活动的减弱与病毒转录、复制间的相互协调机制;并通过滞育卵解除滞育后F_1代蚊虫感染率检测,以及叮咬敏感乳鼠的传播实验,明确登革Ⅱ型病毒能否经滞育卵传递至子代并能进一步水平传播;进而了解垂直传递病毒是否影响滞育卵的孵化及F_1代蚊虫的生殖能力,来探讨自然界蚊媒体内病毒的保存机制以及媒介—病毒—宿主三者之间的相互关系。本研究获得以下几个方面的结果:1 感染白纹伊蚊滞育卵内病毒的检测和分离通过半套式PCR、C6/36细胞培养分离病毒等方法,多角度证实能在感染DEN-2白纹伊蚊滞育卵内检测和分离到病毒,同时常规保存条件下干燥处理的卵内也检测和分离到病毒。另外,研究发现接种C6/36细胞的感染白纹伊蚊常规干燥保存卵导致C6/36细胞病变的时间较滞育卵早12小时左右。2 卵内登革病毒的存在状态利用地高辛标记的不对称PCR扩增产物制备单链探针(正链和负链探针),进行核酸杂交来监测卵内登革病毒复制动态。Southern杂交方法在感染白纹伊蚊滞育卵和常规干燥保存的卵中均检测到病毒正股RNA和负股RNA,但滞育卵中病毒负股RNA杂交信号非常的弱,表明负股RNA含量极低;常规干燥保存的卵内无论正股RNA还of是负股RNA,都有较强杂交信号。正股RNA和负股RNA的成功检测,表明滞育卵和常规干燥保存卵均感染病毒,即用S。"them杂交的方法也能够在感染白纹伊蚊滞育卵和常规干燥保存的卵中均检测到病毒;采用L汇1沉淀的方法将复制中间型(RI)RN A和复制型(RF)RN A分开后,正链探针用于检测复制中间型RN A,负链探针用于确认复制型RNA的合成。斑点杂交结果发现常规干燥保存卵中,RI RNA和 RFRNA均有杂交信号,说明病毒仍然进行着循环复制;滞育卵中检测不到RI RNA和RF RNA的合成,而Southern杂交检测到极少量的负股RNA,表明在滞育卵中病毒复制的相对静止发生在从负股 RNA到 RF RNA这一步。3感染白纹伊蚊不同生殖营养周期F;代蚊虫感染率差异采用半套式PCR、C6八6细胞培养分离病毒等方法检测FI代蚊虫感染率,第一个生殖营养周期滞育卵和常规干燥保存卵内均没有检测和分离到病毒,这与病毒在经口感染的蚊虫体内增殖的时间有关;此外,对第二、三生殖营养周期产卵孵化的于代蚊虫感染率检测结果经统计学检验,结果显示第二、三生殖营养周期FI代蚊虫感染率没有显著性差异…>0刀5人旱感染白纹伊蚊卵的滞育与常规干燥保存对子代感染率的影响采用半套式PCR、C6/36细胞培养分离病毒等方法检测滞育卵和常规干燥保存卵孵化的h代蚊虫感染率,半套式PCR检测结果表明常规干燥保存卵孵化的F;代蚊虫感染DEN-2的批阳性率为 18.8O,子代最低感染率为 1:160(0.63O),明显高于滞育卵孵化的FI代蚊虫感染率(批阳性率为9石%,于代最低感染率为1:294二*.34%厂,/检验的统计结果显示经滞育卵和常规干燥保存卵孵化的子代蚊虫感染率有显著性差异(Xz-2.47,p<0.05人结果表明登革*型病毒能够经感染白纹伊蚊滞育卵和常规干燥保存卵传递至于代。5感染白纹伊蚊滞育卵孵化的h代成蚊叮咬乳鼠水平传播登革病毒低氧水刺激感染白纹伊蚊滞育卵孵化后,羽化5天的F;代雌蚊刺叮1 日龄健康乳鼠,传播阳性率为6.l%,结果表明登革*型病毒能经滞育卵传递至子代并能通过叮咬敏感宿主水平传播。6$染病毒对白纹伊蚊滞育卵的孵化及FI代成蚊产卵量的影响用低氧水刺激滞育卵解除滞育后,收集按时间顺序孵化的7批幼虫,半套式PCR检测其阳性率,发现最早孵化的一批幼虫最低感染率为1:15(6石7%),第二批孵化的幼虫最低感染率为1:75(0.13%),而在此之后……   
[关键词]:白纹伊蚊;登革病毒;滞育;传播;生殖营养周期
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:西南农业大学2003年