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西瓜果实特异性基因wml1 5'端启动子区转录调控功能及其应用研究

吴韩英

  果实的发育成熟涉及一系列复杂的生理生化变化,包括叶绿素的降解、类胡萝卜素的合成、淀粉向糖的转化、芳香性化合物的合成、细胞壁溶解和果实软化等。这些变化是特异性基因表达并发挥作用的结果,启动子的转录调控对基因的特异性表达起了关键作用。wml1是一个在西瓜果实中特异表达的基因,它是ADP葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)的一个大亚基基因。该基因5’端1864bp的启动子序列已被克隆,其中1573bp的序列已初步证明具有果实特异性调控功能。本文对这1573bp的序列进行了缺失分析,发现了控制基因在果实组织中特异性表达的主要功能区域。同时,构建了一套由果实特异性启动子诱导的甜蛋白Brazzein基因的植物表达载体。1.根据已克隆的wmJ1 5’端1573bp启动子区序列内部的酶切位点,采用限制性酶切的方法,获得该启动子序列的一系列缺失突变,长度分别为1197bp、896bp、795bp,经过中间载体pBluescriopt SK(-)获得合适的酶切位点后,3个DNA片段分别代替植物表达载体pBI426的组成型启动子CaMV35S,构建成报告基因GUS的瞬间表达载体。2.1573bp、1197bp、896bp、795bp四个不同长度的wml1 5’端启动子区序列代替植物表达载体pBI121的组成型启动子CaMV 35S,构建成报告基因GUS的植物遗传转化载体,以NPTII为筛选标记基因。3.通过农杆菌介导的遗传转化方法,将4个不同长度的wml1 5’端启动子序列诱导的GUS基因的植物遗传转化载体对番茄子叶外植进行遗传转化,获得再生植株。通过PCR特异扩增、Southern杂交鉴定,证明4个启动子片段诱导的GUS基因已经整合到番茄基因组中。对转基因番茄叶、茎、根和不同发育期的果实进行GUS组织化学分析和GUS酶活性测定结果表明,1573bp、1197bp、896bp三个片段能诱导GUS基因在果实中特异性表达,在其它器官中不能表达,而且GUS基因在果实中的表达强度随果实发育而变化:在授粉后15d和60d时表达较弱,在授粉后30d、45d时较强。在795bp片段调控下,GUS基因不在任何器官中表达。这说明857bp-957bp之间的某一个区域内存在着在果实特异性表达中必需的元件。4.将1573bp、1197bp、896bp、795bp 4个不同长度的wml1 5’端启动子片段诱导的GUS基因的瞬间表达载体质粒对西瓜叶、茎、花和不同发育期的果实(授粉后sd. 10d、20d)进行基因枪轰击。对GUS基因瞬间表达的组织化学分析结果表明,1573hP的启动子片段能诱导GUS基因在授粉后sd、20d的西瓜果实和花中表达,而在授粉后10d的果实、叶、茎中不表达。1197hP、896hP的启动子片段只能诱导 GUS基因在授粉后20d的西瓜果实和花中表达,再在其它器官中均不表达。在795hP片段调控下,GUS基因不在任何器官中表达。这说明180hP-556hP之间可能存在某一个元件参与控制基因在西瓜果实发育早期表达。S57bP分之间的区域缺失导致果实特异性表达的丧失,这说明该区域内存在调控基因在果实中特异性表达的必需元件。另外,本研究结果表明,借助于皮下注射器,农杆菌介导的报告基因GUS的瞬间表达研究,在验证启动于在西瓜成熟果实中的功能上是一种有效的方法。5.以“京欣一号“西瓜子叶为外植体,通过与含有双向载体PB 的农杆菌GV3 101共培养转化,建立了优化的遗传转化体系。该体系采用Zd苗龄的西瓜子叶,子叶外植体去尖端和基端,剩余部分纵切开后再分别横切一次,切好后的子叶外植体在峭十Zing/L 6-BA+0.Zmg/LIAA的培养基上 28OC,暗处预培养 3天后进行农杆菌侵染。侵染前超声波处理20-305,侵染时用农杆菌液浸泡24h,共培养2-3d的处理能获得较高的出芽率和阳性芽的比率。采用该体系,将4个启动于片段诱导的GUS基因植物遗传转化载体对西瓜子叶进行了遗传转化,获得了PCR阳性转化植株。6.1573hp、1197hp、S96bp 3个已被证明有果实特异性调控功能的启动子片段与甜蛋白Brazzein基因融合,构建成适合于农杆菌介导的植物遗传转化载体。……