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新月弯孢霉的甾体11β-羟基化作用研究

王敏

  微生物的11 β-羟基化作用是甾体转化中最重要的反应,可以在甾体母核的C11β位引入氧原子,赋予甾体药物抗炎、抗毒等医疗活性。在工业上应用微生物11β-羟基化作用生产皮质激素药物已有40余年的历史,取得了巨大成就,是甾体医药工业的关键生产技术。主要产品氢化可的松是一种肾上腺皮质激素药物,广泛应用于治疗肾上腺皮质功能不足和自身免疫性疾病,同时也是进一步合成其它药物的中间体。新月弯孢霉(Curvularia lunata)具有较强的11β-羟基化能力,是重要的生产菌种。本文从自然界分离筛选具有11β-羟基化能力的新月弯孢霉,并对其转化甾体RSA的发酵条件,11β-羟基化反应动力学,原生质体细胞的甾体转化条件以及真菌细胞壁抑制剂对甾体转化的影响进行了研究。本文从自然界采集的土样中分离筛选到一株新月弯孢霉C4菌株,具有转化RSA的能力。通过TLC和HPLC等方法分析鉴定,转化产物中除了氢化可的松以外,还有14α-OH、11α-OH等副产物。甾体化合物RSA在转化过程中,首先生成中间产物RS,RS的转化速率决定氢化可的松的生成速率。为提高C4菌株的11β-羟基化能力,在实验中采用紫外线和DES诱变处理该菌株的原生质体,从中筛选到一株形态突变株C114。在固体培养基上,该菌株菌落平坦,气生菌丝短,培养基表面早墨绿色,背面呈黑色,孢子丰富而且颜色深。对影响甾体转化的各种因素进行了优化,确定出最佳发酵条件。发酵培养基由2%葡萄糖、1%黄豆饼粉、0.5%蛋白胨和0.5%酵母膏组成(pH值6.5);最适生长pH值为6.0~6.5,最适转化pH值6.5;摇瓶转速实行分段控制:0~12h控制在160r/min,12h以后提高到200r/min;菌龄25h;底物投料浓度0.1%。在最佳发酵条件下,菌株C114转化0.1%RSA,48h可以生成42.66%的氢化可的松,较出发菌株C4提高了24.5%。本文首次研究了新月弯孢霉转化化合物RSA的11β-羟墓化反应动力学,测定出反应动力学参数Vm 和Km 分别为0.793×10~(-2)g/h L和0.160g/L,建立了11 β-羟基化反应的动力学方程,为调控反应条件、提高羟化酶的催化活性提供了理论依据。以原生质体进行的甾体转化反应为模型,深入研究了细胞壁对甾体转化速率与转化产物的影响。首先确定了新月弯抱霉原生质体的形成条件,将培养 16 h~18 h的菌丝体,以 0石mol/L KCI作为渗透压稳定剂,30C下,经过 1%溶壁酶和 1%纤维素酶混合酶液…H5石)消化4h~5h,原生质体释放量达到最高,为6.11XI0~mL。通过对原生质体的稳定性进行分析,建立了原生质体进行门p一羟基化反应的反应体系。研究发现原生质体不仅保持了自体的羟化能力,而且比对应的菌丝体羟化速度快,11pDH的合成速度是菌丝体转化的1.88倍,而且11卜OH的转化率由32二%提高到41.5%,提高了129倍。副产物14 a0H含量明显升高,提高了3刀3倍,ila-OH与菌丝体转化相比却下降了40%。充分证明细胞壁是衡体转化的重要障碍,不仅影响群体底物转化的转化速率,而且影响产物之间的百分比例。由此推测,菌体细胞壁作为背体底物进入细胞的屏障,不仅仅影响底物向细胞内的扩散,在这个扩散过程中还影响底物的空间构象或底物与羟化酶嵌合时的空间定位。在此基础上,本文采用真菌细胞壁抑制剂多氧菌素,来抑制菌丝体细胞壁的合成,造成菌体细胞壁的松弛,进一步研究它对错体转化速度和转化产物的影响。结果表明在菌体生长过程中,当菌体处于快速生长期前期门~18h)添加l~3mg/mL的多氧菌素,最终可以使问p0H的转化速率提高1.3倍,转化率提高10%,副产物的百分比例也发生了较大的改变。实验结果与原生质体对终体的转化情况相似。通过实验证明了假设理论的合理性。为更深入研究采体转化的调控机制以及选育优良菌种、改善工艺条件打下了坚实的基础。……   
[关键词]:新月弯孢霉;11β-羟基化作用;甾体;氢化可的松;菌种选育;发酵;反应动力学;原生质体;多氧菌素
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:天津科技大学2001年
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