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重组人肝再生增强因子(rhALR)的表达、纯化及生物活性研究

潘韵

  人肝再生增强因子(human augmenter of liver regeneration,hALR)为从人胎肝组织中克隆到的一种新型的促肝细胞增殖因子,它能显著提高CCL_4致肝功能衰竭大鼠的存活率。进一步的研究发现其具有刺激肝细胞DNA合成、抑制肝脏自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)、诱导肝线粒体基因表达、参与肝再生、氧化游离巯基以及参与细胞质铁硫蛋白(Fe/S proteins)合成等多种生物学作用。该蛋白最为人们所重视的是其对急慢性肝损伤的保护作用,因此开展重组人肝再生增强因子(recombinant human augmenter of liver regeneration,rhALR)的研究将推动肝再生机制的理论发展,并可最终用于重症肝病的临床救治。本论文主要工作包括E.coli DH5 α表达rhALR的发酵工艺研究;包涵体蛋白质变性、复性及纯化工艺;重组蛋白的生物活性研究。经过大量实验工作,得到如下结果:1、确定了发酵表达rhALR的工艺。经优化筛选,采用自行设计的复合培养基(酵母粉11.7g,蛋白胨5g,Na_2HPO_49g,KH_2PO_42g,MgSO_41.5g,CuSO_40.004g,ZnSO_4 0.004g,FeSO_40.01g,VB_10.01g,葡萄糖10g,氨苄青霉素0.01 g,胸腺嘧啶0.008g,蒸馏水定容至1L),发酵过程中以氨水调节pH为7.0,溶氧控制30%左右,30℃培养5h,42℃条件下诱导表达4h,同时于培养2h后开始按0.25g/(L·h)补加葡萄糖,200mL/h流加补料培养基。最终菌体湿重达到30g/L以上,rhALR表达量为30%。2、完善了包涵体(Inclusion bodies,IBs)洗涤工艺。经洗涤缓冲液Ⅰ(50mmol/L Tris-HCl(pH8.0),2mmol/L EDTA,0.2%Triton X-100)、Ⅱ(50mmol/L Tris-HCl(pH8.0),2mmol/L EDTA,2mol/L脲)、Ⅲ(50mmol/L Tris-HCl(pH8.0),2mmol/L EDTA,70%异丙醇)、Ⅳ(50mmol/L Tris-HCl(pH8.0),2mmol/LE DTA,2%脱氧胆酸钠)依次洗涤,除去了绝大部分菌体碎片与膦脂、杂蛋白等杂质,最终包涵体纯度可达到85%。3、包涵体蛋白以6 mol/L盐酸胍及50 mmol/L β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol,β-ME)溶解后,于含有0.5mol/L精氨酸的缓冲液中稀释复性72h,活性实验证明复性后的蛋白质恢复了其生物活性。复性蛋白质先以离子交换树脂纯化(Pharmacia DEAE-Sephadex填料;XK50/20(CV=392.5mL)色谱柱;流速10 mL/min;0~0.5 mol/L NaCl洗脱,洗脱体积2000mL),所得目的蛋白峰经浓缩,再经凝胶过滤纯化(Pharmacia Sephadex G-50 fine凝胶;XK16/80(CV=160.76mL)色谱柱;流速1mL/min;以0.9%NaCl洗脱,),最终纯化得到的rhALR蛋白质纯度达到97.9%。浙江穴学 生物系统工程与食吊科学学院4、SD}PA*E测d 山**R巾仰分户吐约15 KD,-:浆休分厂*约30 KD,X电点几6、H~685U川。氨从暇川;Z分析i厂u],厂狄扎”1!4n[雌纵成‘厂川沦利I符,采J 从质车 助r山敞) 册吸电离匕卞 时问质消 (;**n气 ***。s比dh**。-d*Sol·puoIVmn。zah0。。u,nc Of mgl二。nass sp*a。·O。。。删rX M八I。DITOFMS)粘丁 测)trhALR分子聚为 30088 Da。5、动物实验证明 山**R能够他勾CC!4致芯性川’W伤小鼠的什汛率爿。能修夏受损的肝纠1胞;采川V1dr掺入法正明了亚纵的1;A*R h\门能够中u激HTC川’癌纠M过株DNA合成;采川IMTT认川J明了。厂童M们 卜ALR洲”mB够促进NIN3*3细胞线粒休脱氢酶的活件。6、采川M**D卜*0卜MS测人经冰余变性仆X州》b化沏上叮山;上AL!《负l”门}于最为30780 Da,与川沦俏不符。并通过测定腆蛋;二J酶附解蛋白质肽段分于嫩,证明尿索分肋释放的氰暇盐介变性过从川。。。IJ。山*LRd北A链1:的帧在腋犹基的 c扶丛反1 口被修忻的山ALR蛋且 质5一fZ增加冒 等u点陇低,问时导致rh*LR Z,k合F*D能力阶低,氧化琉从汛性下1坏。通过测定俯&叫A段分了虽,推测出 山A*R步1丫。1“能的二硫键纠介力人。7、通过力复卜过w琶力入**D(门。vh。de巾ne**uofe0u*,主素腺嘿n--核计暇)j包涵< 蛋门 U介仰夕’jrh八卜R纠介口验illZ 厂fAD为门1A卜民’灶见脓丛枫化酶活性的必从组分,但不影响 山ALR对CCL孜川}W。小鼠川邻川b的修复刊川】及促进NIN3*3细胞线粒仆脱氢啊活性的仆川。与 *LR卞公X地过戍化斩三二了助上它生K!人门 二J用成小啪纠构和参勺 巨胞质饮{ 炎I人】介* 巨JI勿Uq十川J门川V理论不【。O,认为山*LR能够独)参U什冉生的训拧。……   
[关键词]:重组人肝再生增强因子;发酵;蛋白纯化;肝再生;质谱;生物活性
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:浙江大学2003年