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桑树转水稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Oryzacystatin)基因的研究

王洪利

  桑树虫害是造成桑叶减产、蚕茧减收的主要因素之一。利用植物基因工程技术开展桑树抗虫性分子育种研究是蚕桑生物技术的发展方向。目前,用于植物抗虫工程研究的抗虫基因主要是苏云金杆菌毒蛋白(Bt)基因和蛋白酶抑制剂(Pl)基因,但Bt和大多数的Pl都对鳞翅目昆虫具有毒杀作用,而家蚕是鳞翅目昆虫的一种。因而桑树抗虫基因工程研究不能利用Bt和大多数的Pl基因。而水稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Oryzacystatin)基因本身是植物天然的抗虫基因,大量的研究认为水稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂对鞘翅目害虫有较强的抑制作用,而对鳞翅目昆虫无特异性抑制作用。因此,本研究在优化桑叶片培养再生技术体系的基础上,选择水稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因作为目的基因,利用农杆菌介导法和基因枪轰击法进行桑树遗传转化研究,获得了初步成功。1.通过比较植物激素和抗生素对桑树新一之濑试管苗不定芽分化影响的研究,结果显示:6—BA与NAA的比例以20∶1到30∶1都能分化出较多的不定芽;在含果糖(F)较多的分化培养基上,叶片分化后不定芽生长能力较强;各种抗生素只要在适宜的浓度范围内对不定芽的分化能力影响不显著。2.利用根癌农杆菌介导法进行了水稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Oryzacysta—tin)基因的遗传转化研究。通过对影响桑叶片培养和遗传转化条件的试验研究,认为桑树受体对OC基因或携带OC基因的载体亲和性较差,因而根癌农杆菌感染后抗性筛选所得到的不定芽分化率很低,其遗传转化效率仅0.5%左右。对得到的少数转基因抗性苗进行PCR检测、DNA点杂交、Southern blotting鉴定证实,首次将水稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因(OC)导入到桑树组织细胞,并整合进再生植株的基因组中。3.通过对基因枪轰击参数与桑树遗传转化效率的研究表明,中等大小的桑苗茎尖、冬芽、腋芽及愈伤组织均可作为基因枪法遗传转化的受体。最佳参数以轰击强度为7cm距离、压力为1350psi,最适金粉用量为每枪500ug,在此浙 江 大 学 博 士 学 位 论 文条件下轰击受体材料所得到的遗传转化频率最高。4.本研究首次成功地利用基因枪轰击法将水稻半脱氨酸蛋白酶抑制剂基因(OC)导入到桑树组织细胞中。经 PCR。DNA点杂交、Soutnernbloting鉴定以及RNA点杂交、Northern bloting鉴定,不仅证实外源基因已经整合进再生植株的基因组中,并且己经在mRNA的水平上进行了表达。同时证实RNA的表达量在不同的转基因植株间有较大差异,即使是同一转基因植株的不同器官中,RNA的表达量也存在着一定的差异。……   
[关键词]:桑树;水稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因;组织培养;遗传转化;根癌农杆菌;基因枪
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:浙江大学2002年