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作用于HIV gp41的病毒融合抑制剂高通量筛选的方法学及天然来源的药物筛选研究

刘叔文

  艾滋病(AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(HIV)感染引起的,目前已呈爆发性流行趋势。由于耐药性和毒副作用等原因,许多HIV感染者或艾滋病病人已不能采用现有的逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂进行治疗,因此急需发展具有新作用机制的抗HIV药物。HIV gp41是HIV的跨膜糖蛋白,其功能为介导HIV包膜与靶细胞膜的融合,在病毒进入靶细胞的早期阶段发挥关键的作用。因此,HIV gp41可作为开发抗HIV药物的一个新靶点。gp41的胞外区存在N-末端重复序列(NHR)和C-末端重复序列(CHR),它们相互作用能形成六螺旋束结构,将HIV包膜与靶细胞膜拉近,介导二者的融合。因此,任何化合物如能抑制NHR和CHR的结合,使六螺旋束结构不能形成,就能阻止病毒进入靶细胞,从而保护免疫细胞不被感染。研究目的:研究针对HIV gp41靶点的融合抑制剂高通量筛选方法,探讨其应用于复杂组分样品筛选的影响因素。同时,采用该高通量筛选方法,从微生物发酵液、中药、蛇毒等天然来源的样品中,寻找能特异性抑制gp41六螺旋束核心结构形成的活性成分。实验方法与结果:1.作用于gp41的HIV融合抑制剂高通量筛选方法的研究。采用特异性更高的单抗NC-1包被,去掉“生物素-亲合素”放大体系,尽可能地使用国产试剂,本研究成功地在国内移植了姜世勃等建立的作用于gp41的HIV融合抑制剂高通量筛选方法。改进的方法与原始方法相比,步骤减少,检测时间缩短,且具有相同的敏感度和更好的特异性。最适条件为:2μg/ml的NC-1包被,N36和C34等量至终浓度1μmol/L,5 μg/ml兔抗gp41核心结构抗体用于结合形成的N36/C34复合物。在pH为6~9的环境下,该筛选方法基本稳定,有机溶剂本身也不产生干扰。因此,改进的筛选方法能用于微生物发酵液、中药、蛇毒等复杂组分样品的高通量筛选。第一军医大学博士学位论文2.天然来源的药物筛选研究采用本研究改进的筛选方法,选择了不同来源的样品,包括985份放线菌发酵产物样品,9种文献报道具有抗HIV作用的中药,以及6种蛇毒样品,进行 HIV融合抑制剂的筛选。结果表明,118个放线菌发酵产物样品、2种中药以及5种蛇毒样品具有抑制PP4六螺旋束核心结构形成的活性。l)放线菌来源的HIV融合抑制剂筛选。118个阳性放线菌发酵产物样品中,有83个能特异性抑制PP41六螺旋束核心结构形成,其中有 6个样品能抑制细胞融合和 HIV诱导的 CPE效应,25-04样品的抑制作用最明显。25-04菌株为吸水链霉菌,我们筛选了7种培养基,从中挑选了一种作为25-04菌株液体深层发酵的培养基。该培养基组成为:葡萄糖2见淀粉1儿蛋白陈0.5兄玉米浆1.5儿NaCI0.5%,CaCO30.5%,泡敌0.035%,Pll7.2~7.4。培养基中易被利用的氮源,如州比)石 等,能抑制活性物质的产生。2504的液体深层发酵表明,抑制PP4核心结构形成的活性成分存在于发酵液中,该成分分于量大于3000,不耐热,仅在 pH 5~9范围内稳定,蛋白酶抑制剂能使其活性丧失。活性追踪分离表明,该物质不能被大孔树脂吸附和解吸,但能用有机溶剂沉淀或硫酸按盐析,不被DEAE-Sepharose柱吸附。因此,25-04的活性成分推测是一类特异性较强的蛋白酶。2)中药来源的HIV融合抑制剂筛选。本研究从9种具有抗HIV活性的中药中发现仅夏枯草和贯众两种中药水提物具有明显抑制PP4六螺旋束核心结构的形成的活性。其中贯众还能抑制m卜1诱导的nE效应和HIV核心抗原陀4表达的活性。夏枯草和贯众对PP4六螺旋束核心结构形成的抑制作用与它们多酚类物质的含量线性相关。用聚酚胺柱去除提取物中的多酚类物质能显著降低其抑制活性。从聚酚胺柱上洗脱下来的多酚类物质与揉酸纯品具有相似的抑制活性,且HPLC表明具有相似的保留时间。因此,贯众、夏枯草水提物中抑制PP4核心结构形成的活性成分主要是多酚类化合物。躁酸,不管是来源于S i gma公司的还是匝海化工厂的产品,都具有相似的抑制PP4六螺旋束结构形成的活性,两种躁酸的半数抑制浓度2第一军医大学博士学位论文HC*分别为0.82和0.96 W加1。同样,两种躁酸均能抑制细胞融合、合胞体形成和HIVl诱导的CPE效应。因此,躁酸能通过抑制gP41核心结构的形成,干扰HIV与靶细胞的融合来抵抗HIV的感染。3)蛇毒来源的HIV融合抑制剂筛选。筛选了6种蛇毒样品,有5种蛇毒样品具有抑制PP41六螺旋束核心结构形成的活性。用透析的办法发现,其中的活性成分不是肽类物质。另外,加热煮沸和蛋白酶抑制剂均破坏蛇毒对N36与C34结合的抑制活性,说明蛇毒的活性成分可能为蛋白酶类物质,通过水解N36或C34,导致N36/C34复合物不能形成。眼镜蛇毒中的蛋白酶成分对己形成的 N36/C34复合物与NC-二的结合影响较小,因而其抑制活性具有较好的特异性。不是所有的蛋白酶都具有抑制PP4六螺旋束结构形成的作用。胰蛋白酶和Natrahagin……