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羧肽酶菌株的筛选及其酶的分离纯化、酶学性质的研究

冯红霞

  本论文包括四个方面的内容:文献综述;大豆多肽底物的制备;羧肽酶菌株的筛选、鉴定和产酶特性的研究及影响发酵液酶活的因素;酶的分离纯化和酶学特性的研究。主要研究结果如下:1.利用胃蛋白酶分解大豆分离蛋白制备大豆多肽,确定了多肽底物制备的条件是在pH=2。0,T=37℃,E/S=1:100(w/w)的情况下10h的水解产物。用正丁醇提取大豆多肽中的苦味肽,确定了它的分子量分布范围是在300~1500D之间,在大豆多肽中所占的比例为24.1%。2.各地采集大量土样,从中分离到的多种细菌、酵母和霉菌中筛选到一株产羧肽酶菌株(Carboxypeptidase producing strain),即CP-1菌株,根据该菌株的菌落形态和菌体形态特征确定它属于曲霉属。氨基酸自动分析仪分析该菌的发酵液作用大豆多肽后的产物,确定该菌发酵液能够分解大豆多肽,释放多肽中的疏水性氨基酸,达到脱苦的目的。同时CP-1菌株发酵液还可以以Sigma公司的二肽Cbz-glu-tyr为底物,进一步证明了该菌株为羧肽酶产生菌。3.以1%的豆粕粉,0.5%麸皮为液体培养基,30℃发酵72h制备粗酶液。通过(NH_4)_2SO_4盐析,酒精沉淀,DE_(52)阴离子交换树脂和Sephadex G-100凝胶层析柱对羧肽酶进行分离纯化,纯化后的羧肽酶进行SDS-PAGE电泳,测定该酶的分子量。最后得到一条区带,根据标准蛋白质电泳的标准曲线计算该羧肽酶的分子量分别为15,942D。与文献报道中米曲霉、黑曲霉所产的羧肽酶相比较分子量要小一些。4.以Cbz-gly-tyr为底物时,该羧肽酶的最适pH值为5.0,最适温度为30℃。在pH和温度的稳定性试验中,发现该酶在pH6~7的范围内比较稳定,过酸和过碱的条件下都不稳定。该酶对热不很稳定,50℃,30min,有72%以上的酶活丧失。Cu~(2+)和金属鏊合剂EDTA对羧肽酶的活性有抑制作用,而Mg~(2+)、Fe~(2+)、Mn~(2+)、Ca~(2+)、Ba~(2+)对羧肽酶有激活作用。本实验的创新之处在于:1)对大豆中的苦味肽进行了提取,并对它的组成、分子量分布进行了初步研究。2)本实验采用的菌株是曲霉菌,利用其发酵液作用于多肽(包括胃蛋白酶分解大豆分离蛋白制备的混合大豆多肽,和氨基端封闭的合成二肽)3)对该酶进行了分离、提纯,并进一步研究了它的酶学特性。……   
[关键词]:底物制备;羧肽酶菌株筛选;酶的分离纯化;酶学特性
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:南京农业大学2002年