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玉米遗传转化再生体系的建立及玉米矮花叶病毒外壳蛋白基因的克隆、遗传转化研究

刘小红

  目前,玉米转化仅限于少数培养性能好的自交系材料,如A188、B73及其衍生系,而对农艺性状优良的自交系应用较少,本研究旨在建立一套稳定、高效的遗传转化体系,包括优良受体材料的选择和培养基配方的改良,同时获得抗除草剂的优良玉米育种材料。玉米矮花叶病是造成玉米减产的一种重要病毒病害,目前尚无有效的化学药物加以防治,而利用反义RNA技术培育抗玉米矮花叶病的转基因玉米是一条防治玉米矮花叶病害的经济、有效的途径。本研究旨在从感染玉米矮花叶病的玉米材料中克隆玉米矮花叶病毒外壳蛋白基因的cDNA,构建其表达载体,导入优良玉米自交系,直接为农业生产提供抗玉米矮花叶病毒的优良育种自交系。现取得的进展如下:(1)不同材料最适培养基的确定通过Y0、Y1、Y2、Y3、Y4、YD等6种培养基和178、8160、8108、黄早四、501、C_Ⅲ6种材料共36种组合的愈伤组织诱导率(Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型三种)统计,结果表明YD在所有材料中愈伤组织诱导效果较好,供试材料愈伤组织在6种培养基上的平均诱导率分别为48.4%、45.1%、40.9%、40.9%、44.6%、52.8%。用YD培养基对R18等23份材料进行组培试验,结果表明R18、4380/陕综5、8108、3189/4380、先早17、G53、C_Ⅲ、178、501等9个材料相对较好,其愈伤组织诱导率×胚性愈伤组织诱导率×分化率分别为80.8%、56.3%、35.3%、32.9%、25.9%、22.9%、13.8%、10.9%、8.0%。(2)玉米遗传转化体系的建立及抗除草剂转基因植株的获得于2000年选用R18为受体材料,用基因枪法导入Bar基因(抗除草剂草丁膦),建立起了遗传转化体系。获得了转基因植株18棵,收获种子8穗,对T0代、T1代植株作PCR、PCR-Southern分子鉴定,结果显示:Bar基因已整合到T0代受体基因组的有17株,并稳定遗传至T1代。对T1代、T2代的表型鉴定及进一步的分子鉴定正在进行之中。(3)MDMV-CP基因的克隆及其表达载体的构建从感染玉米矮花叶病毒的玉米叶片中克隆了MDMV-CP基因,通过测序并作同源性分析,结果显示:编码MDMV-CP基因由660个碱基组成。同源性比较为MDMV-KS1(A34978):62.3%、MDMV-A(A34974):80.0%、MDMV-B(A34976);91.2%、MDMV-B(CN)(S77088):98.5%。构建了p35Scpbar、P35ScPfbar两个表达载体。O)MDMVCP &因的邀传转化于2001年秋用基因枪将MDMVcP基因巾35Scpbar质粒)导入*、W18、501三个优良自交系,利用已建立好的遗传转化体系,经抗性筛选、分化、壮苗等步骤,已得到抗Bastar(有效成分 PPT)植株 213棵,其中 R18 103株、W18 90株、501 20株。其分子检测正在进行之中。……   
[关键词]:玉米矮花叶病毒;除草剂;表达载体;遗传转化
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:四川农业大学2002年