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1.低氧诱导因子1与PC12细胞缺氧复氧损伤关系的研究 2.中国福建尖吻蝮蛇蛇毒类凝酶止血作用的实验研究

倪永兵

  缺氧能引起神经细胞损伤,复氧反可加重损伤。造成这种损伤的原因很多,精确的机制尚未阐明。低氧诱导因子1(HIF-1)是由α亚单位和β亚单位组成异二聚体,其中HIF-1α是专一性调节O_2的HIF-1亚单位,决定了HIF-1的活性。它可以调控血管内皮生长因子、血红素氧合酶、酪氨酸羟化酶等基因的表达,是一种与血管生长、血流供应、能量代谢等基因转录表达有关的重要调节因子。我们用传代培养的PC12细胞来替代原代培养的神经细胞,用氯化钴来模拟缺氧,去除氯化钴模拟复氧,探讨HIF-1与神经元缺氧复氧损伤之间的关系,以及反义RNA对HIF-1a蛋白表达的影响,对于研究缺血缺氧性脑病,脑缺血再灌注等血管新生性疾病的生物学治疗意义重大。离体培养的PC12细胞长满瓶底后,加入终浓度125uM氯化钴的培养液,孵育0、1、2、4、8、12、16h,检测细胞培养上清液中LDH的漏出;并收集缺氧0、1、4、8、16h细胞,戊二醛固定,切片,电镜观察细胞超微结构的改变。结果发现:在缺氧过程中,LDH的漏出逐渐增加,8h达高峰,而后降低;电镜观察也支持上述结果,出现空泡样改变,线粒体消失等。在检测细胞损伤的同时,我们采用RT-PCR技术观察缺氧后HIF-1α mRNA的表达,发现在缺氧0h也有低表达,而后表现为时间依赖性,在缺氧4hmRNA的表达达到高峰,而后逐渐降低。为进一步探讨HIF-1在神经元缺氧复氧损伤中的关系,我们去除氯化钴模拟复氧,观察复氧0、4、8、12h细胞培养上清液中LDH的漏出、细胞超微结构的改变以及mRNA表达,结果发现:在复氧8h,LDH的漏出及细胞超微结构的改变最明显。与此相反,其mRNA表达在复氧4h降到最低。因此,我们推测HIF-1在神经元缺氧复氧损伤中起着某种保护作用,但深入的机制我们南京医科大学硕士学位论文仍在进一步研究之中。基于以上发现,我们采用兔疫荧光技术,用激光共聚焦荧光显微镜来观察缺氧复氧不同时间HIF八 蛋白的表达,结果发现:缺氧后蛋白的表达也表现为时间依赖性,在缺氧sh,检测到的荧光最强,而后逐渐降低;在复氧sh,蛋白的表达降到最低与RTPCR的结果基本相似;而在复氧sh,细胞损伤最为严重,这进一步表明HIF刁在神经元缺氧复氧损伤中起保护作用。为探讨反义MA对*F叶 蛋白表达的影响,我们设计出*F\正义、反义叫A探针(用硫代磷酸化修饰),设三个实验组(对照组,HI RNA组,反义叫A组)。PC12在用氯化钻缺氧处理6b同时,分别与正义RNA、反义N A共同孵育O、I、2、4、8、12、16h;收集细胞,口定,用一抗、二抗封闭,观察荧光。友现该蛋白在细胞浆和胞核中均有表达;在给予相同数量门)的反义RNA后,该蛋白的表达受到抑制(以胞核蛋白的抑制为主),在缺氧4、sh最为显著。综上所述,HIF<在神经元缺氧复氧损伤中起一定保护作用,反义RNA育4制缺氧后HIFla蛋白的表达。……   
[关键词]:缺氧;复氧;氯化钴;LDH;细胞超微结构;HIF-1a mRNA;反义RNA;HIF-1a蛋白
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:南京医科大学2002年