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高效广谱苏云金芽孢杆菌Ly30株的分子生物学研究

姚江

  本论文对拥有自主知识产权(专利申请号:01108274)的Bt菌Ly30株进行了系统的研究。首先从形态学水平上确定该菌株杀虫晶体蛋白组分及多种形态的伴孢晶体,进而确定其杀虫谱及毒力高低,然后深入到分子水平,鉴定了ICPs基因的种类,并对ICPs基因进行克隆、表达及生物活性测定。主要结果如下:1.电镜观察Ly30株拥有大菱形、小菱形、方形、不规则形以及镶嵌形等多种形态的伴孢晶体。SDS-PAGE检测其至少拥有2种蛋白组分,分子量分别为135-140kDa和60kDa,也有弱的85kDa和70kDa蛋白表达。生测结果显示,该菌株不仅对小菜蛾、棉铃虫等鳞翅目昆虫有较高的毒力,其LC50分别为0.022 μg/ml和2.252μg/ml,而且还对直翅目、双翅目昆虫表现一定的毒效,如对黄胫小车蝗(Oedaleusinfernalis de Saussure)的校正死亡率为81.82%,对尖音库蚊(Culex pipiens Linnaeus)的LC50为19.8μg/ml。Bt菌株对直翅目昆虫有毒效未见国内报道。2.CAPS系统鉴定该菌株至少拥有5种cry基因。采用完全酶切或部分酶切建质粒库、PCR粘端定向克隆等方法,分离克隆了5种cry基因,并进行了序列测定。在GenBank中登记,并获得国际Bt杀虫蛋白命名委员会的正式命名,分别为cry1Aa12(AF384211)、cry1Ac14(AF492767)、cry1Ia9(AF521013)、cry2Aa10(AF433645)和cry2Ab5(AF389442)。序列分析表明与已发表基因的氨基酸序列最高同源性分别为100%,99%,99%,100%和99%。3.完成了cry1Aa12、cry1Ac14、cry1Ia9和cry2Ab5基因在E.coli受体菌中的高效表达,以及cry2Aa10基因在Bt无晶体突变株中的表达,后者可形成典型的方形晶体。4.生物活性测定表明,Cry1Aa12、Cry1Ac14蛋白对鳞翅目昆虫具有较强的毒力(如Cry1Aa12蛋白对小菜蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾的LC_(50)分别为0.554μg/ml、3.504μg/ml和3.276μg/ml),是菌株对鳞翅目昆虫高毒力的主要体现者。首次鉴定了Cry2Aa10蛋白对黄胫小车蝗有活性(校正死亡率69.73%);Cry2Aa10、Cry2Ab5蛋白对尖音库蚊幼虫有活性(其LC_(50)分别为10.7μg/ml、8.3μg/ml)。中国农业科学院博土学位论文20025.禾用重叠PCR技术,获得c州a10操纵元内o呐、of’fi、o功+o昨和p hi基因的融合片段,以pHT3构建原核表达载体 pFU…I’fi+ZAbXpFU(oy+ZAb)和PFU…功+O吵+ZAb卜结果表明,Orfl及其上游启动子可帮助CryZA hi基因表达,Oof和Oyt同时存在不仅有助于CryZA bs表达,还能帮助形成规则方形晶体,具有分子伴侣khapTone)的作用。6.HITmp Q柱层析分析结果表明,各基因产物均表现为一定特征的紫外吸收峰,可作为分离和鉴定 ICPS蛋白的参考。另外,初始菌株 BiLy30和各基因产物吸收峰之间具有较高的一致性,从而在蛋白表达的层面上证明了各基因的存在。7.通过离心超滤和热处理,结合生物测定,初步证实BiLy30菌株培养物上清液中还能产生耐热的增效物质,其增效作用因不同基因产物而异。……   
[关键词]:苏云金芽孢杆菌Ly30株;cry基因克隆和表达;晶体形成;鳞翅目;直翅目及双翅目害虫
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国农业科学院2002年