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番茄环斑病毒及转基因产品的分子检测技术研究

赵文军

  番茄环斑病毒(tomato ring spot virus ToRSV)广泛分布于欧美,危害多种重要经济作物,严重者导致绝产,目前国内尚未发现,因此被我国列为一类检疫有害生物,应实施严格检疫。目前广泛应用的植物病毒检测方法为血清学检测,其灵敏度及可靠性不能达到出入境检验检疫的要求。反转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction RT-PCR)是一种快速灵敏的分子生物学检测方法,但存在漏检和假阳性现象。本试验在RT-PCR的基础上设计了杂交诱捕引物及杂交探针,优化了杂交诱捕参数,建立了杂交诱捕RT-PCR-ELISA(hybridization capture RT-PCR-ELISA HC-RT-PCR-ELISA)。该方法的基本步骤是:将5 端氨基化的反向引物共价交链在PCR管上,在一定条件下特异性诱捕核酸粗提液中的靶标核酸,然后洗掉杂质及聚合酶抑制物质,完成核酸的诱捕。固相引物既参与核酸的诱捕,又参与PCR扩增。扩增中,在Taq酶的作用下,扩增产物沿着该引物延伸,形成一条固定在管壁上的链称之为固相产物。对液相产物进行凝胶电泳检测的同时对固相产物进行杂交检测。该方法将PCR与ELISA有机结合起来,利用了PCR的高效性与ELISA的高特异性,而建立的一种新的分子生物学检测技术。作为一种新的检测方法,与传统的RT-PCR相比有如下改进:1)改变了核酸提取方法,利用杂交诱捕法直接从核酸粗提液中诱捕核酸,尤其适合于病毒含量低、Taq酶抑制物质含量高的植物材料,减少了核酸提取的时间及试剂费用。2)结果可靠:杂交特异性诱捕靶标片段的同时去除了核酸中存在的PCR抑制物质,减少了因核酸提取不纯造成的漏检现象,减少了非特异性扩增,结果输出通过双重判定,保证了结果的可靠性。3)灵敏度高:通过杂交进行结果判定,灵敏度比传统的RT-PCR大约高10倍,可以检测出10ug植物材料中的ToRSV。实时荧光PCR(real time fluorescent PCR RT-F-PCR)是一种不需要进行凝胶电泳,而是在PCR反应中直接通过荧光探针杂交检测扩增产物的的方法。将杂交诱捕与实时荧光PCR结合起来,诱捕后直接进行反转录RTfPCR(HC-RTfPCR)检测,该方法检测灵敏度可达到10fig。HC-RTfPCR方法比HC-RTICRELISA方法减少了操作步骤;同时由于不走电泳也减少了核酸污染的可能,节省了检测时间,从核酸诱捕到病毒检测完成只需3h,提高了检测效率。HC-RT-PCR-ELISA和 HC-RT-F-PCR同时作为的检测方法,结果输出都是通过探针杂交后仪器输出,灵敏度相当。前者仪器操作简单,费用低,易于推广应用。后者自动化程度高,工作量小,更快速,结果输出更直观,是一种很有应用前景的病原物检测方法,但目前仪器昂贵,试剂费用高,暂时还难以推广。利用所建立的 HC-RT-PCR-ELISA和 HC-RT-F-PCR对法国进口的 6株怀疑感染有ToRSV的葡萄种苗进行了检测,发现四株带有TORSV,两种方法检测结果完全一致。从南瓜花叶病毒kquash mosaic virus SqMV)RNAZ保守序列设计引物,用HC-RTPCRELISA检测北京郊区采集的南瓜材料上的SqMV,结果发现所用的6个样品全部带有 SqMV,用巢式 PCR(Nest PCR)对检测结果进行了验证,证明了HC-RT-PCR-ELISA检测结果完全正确。由于转基因产品(geneticallymodifiedorganismsGMOs)潜在的非安全性及国际贸易争端,包括中国在内的许多国家,尤其是欧盟要求对进口产品进行转基因检测。355启动子、NOS终止子及 NPT 11基因是目前转基因检测常用的3个基因。将180hp的DNA片段包被到PCR管上进行核酸诱捕,洗掉杂质后直接在该管内作PCR,结果3个基因全部检测出。而非转基因样品未检测到任何基因,证明了HC-PCR检测结果的准确性。……   
[关键词]:植物病毒;番茄环斑病毒;ToRSV检测;杂交诱捕-RT-PCR-ELISA;杂交诱捕-RT-F-PCR;转基因产品
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:西北农林科技大学2002年