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花生微卫星DNA的分离与多态性研究

高国庆

  花生是一种重要的经济作物和油料作物,尽管其农艺性状存在着广泛的遗传变异,但在DNA分子水平上的差异却十分有限。微卫星DNA或简单重复序列(SSR)是近年来发展的一种新的DNA分子标记,由于这种标记在基因组内含量丰富且变异水平高,从而被用来作为建立分子图谱的标准标记技术之一。微卫星DNA的分离有多种方法,其中传统的方法是用放射性标记的SSR探针筛选基因组文库,这种方法所需时间长、工作强度大、消耗多、效率低,不宜用来从含量并不丰富的植物基因组中分离微卫星DNA,同时当需要获得大量的SSR标记来建立遗传图谱时,这一方法也不适用。本研究先将基因组DNA转化成选择性扩增的DNA片段(AFLP),然后用生物素标记的SSR作探针与其杂交,杂交后的片段与包被在磁珠表面的链亲和素(streptavidin)结合,经过一系列的洗涤过程后,不含SSR的部分被洗掉,而含有SSR的AFLP片段被大量富集。研究中采用了两种富集方法,第一种方法是所用的DNA片段是经过具有三个选择性核苷酸引物扩增的AFLP,富集后的产物经过扩增后在聚丙烯酰胺胶上呈现清晰的条带,将这些专一性条带中的DNA提取后扩增、纯化,直接用于测序。总共用10个SSR探针对从235对AFLP引物扩增的DNA片段进行了富集,并获得了155条专一性条带,对其中121个片段进行了序列分析,得到9个含有微卫星DNA的序列。根据序列结构,设计了9对引物,其中7对引物扩增成功。所有引物在22个花生品种中均未能检测出多态性。但是,通过改变扩增条件,其中的一对引物,即Pm-8的扩增产物中,有两个来字墨西哥的品种,即PI576613和PI576617,缺乏一条专一条带。Pm-8的扩增产物并不是典型的微卫星DNA类型,而是一个序列标签位点(STS),这一标记在辨别品种方面可能会有一定的作用。在第二种方法中,用于富集SSR的DNA片段是经过一个选择性核苷酸AFLP引物扩增产物。实验公选用5个SSR探针,即(GA)_(15),(GT)_(15).(AT)_(15),(GGC)_(10),(ATT)_(10).所采用的AFLP引物是HindⅢ-A/MseI-N,Mse-N,(N代表四种核苷酸中的一种)。AFLP片段经过磁珠筛选富集后,洗脱下来的含有SSR的片段克隆到质粒中。插入的片段在细菌中经繁殖后用T3/T7引物扩增,用琼脂糖凝胶分离,经纯化后用于测序。共对208个克隆进行了序列分析,在排除了序列相同的克隆后,共得到了14个克隆含有微卫星序列,据此设计了14对引物,用以扩增44个栽培花生的基因组DNA。在14对引物中,Pm-15检测到4个等位基因。其他23对引物(含用第一中方法获得的引物)均未能扩增出多态性产物。结果还表明,花生基因组中GA/CT重复序列含量最丰富,其次是GGC/CCG序列。在两种分离方法中,第二种方法所时间短,试剂消耗少,经过适当改进,可作为从花生基因组中分离微卫星DNA的有效方法,而第一种方法则因为磁珠表面与 AFLP DNA之间的非专一性吸附难以避兔并且耗费较大,不宜采用。本研究首次采用磁珠富集AFLP片段中的微卫星序列,并获得了多态性SSR标记,为进一步从花生中分离大量的多态性微卫星标记提供了可靠的实验方法。……   
[关键词]:DNA;微卫星;SSR;简单重复序列;多态性
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:福建农林大学2002年
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