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LEA3蛋白基因对草莓的遗传转化研究

王俊丽

  草莓(Fragaria ananassa Duch.)是一种经济价值较高、分布范围较广、颇受人们喜爱的多年生草本果树,其产量居小浆果之首。但盐碱和干旱给草莓生产带来越来越严重的影响,选育抗旱耐盐碱的草莓新品种十分必要。现代生物技术的发展为果树的育种工作开辟了新的途径,外源基因的导入则是育种工作更为直接的有效手段。以不同品种草莓(达赛和丰香)花药为外植体,在附加6-BA与2,4-D、6-BA与NAA的MS培养基上进行培养,均可诱导出愈伤组织。当花药在附加2.0 mg/L6-BA和0.5 mg/L NAA的培养基上进行培养时,愈伤组织诱导率最高。草莓的基因型不同,诱导率不同,达赛和丰香的诱导率分别为98%和85%,达赛的诱导率明显高于丰香。所诱导的愈伤组织经过2~3次继代培养,即可得到生长状态较好、胚性较强的愈伤组织。选用生长状态良好的愈伤组织作为受体组织,借助PDS-1000型基因枪,将含有米自大麦(Hordeum vulgare L.)的胚胎发生晚期丰富蛋白LEA3基因的pBY520质粒DNA导入草莓愈伤组织细胞(ActⅠ为启动子,PINⅡ为终止子,BAR基因为选择基因)。将转化后的愈伤组织接种到LS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L+PPT 10.0 mg/L+蔗糖30 g/L的选择培养基中进行选择培养,每10天继代1次,连续选择4次,共得到347块抗性愈伤组织。将抗性愈伤组织转接到附加2.0mg/L 6-BA利0.1 mg/L NAA的MS培养基上进行再生培养,共有48块抗性愈伤组织再生,再生率为13.8%。用EcoRⅠ和XbaⅠ对质粒DNA进行双酶切,得到1.Okb LEA3片段,并用地高辛标记法进行了LEA3基因探针的制备。通过DNA dot blot分析,对22个转化株进行筛选,其中15株检测到杂交斑,阳性率为68.2%。对点杂交为阳性的植株进行Southern blot分析,转化植株检测到了杂交带,除预期的1.Okb杂交带外,还有其他片段人小不等的杂交带。不同的株系形成不同的杂交谱,表明这些转化植株来自不同的转化细胞。RNA dot blot分析,转化植株检测到了杂交斑,表明LEA3基因在草莓细胞内能够进行正常转录。Western blot分析,在转化植株中检测到了27KD杂交带,表明在转化草莓体内有外源基因翻译产物的积累。分别用50mmol/L和100mmol/L NaCl进行盐胁迫处理,对照株的萎蔫率分别为60%和100%,而转化株的萎蔫率分别为16%利40%,转化株的萎蔫率明显低于对照。一周后解除胁迫,对照株的存活率分别为48%和0,而转化株的存活率分别为80%利56%,转化株的存活率明显高T对照。结果表明,LEA3 基冈导入草谴细胞后,与对照相比转化细胞再生植株抗盐性明显增强,并且在受到盐胁迫时,转化株萎蔫症状出现晚,受害程度轻,一口.解除胁迫,能较快恢复止常生K。……   
[关键词]:草莓:LEA3蛋白基因;转化;再生;抗盐性
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:河北农业大学2002年