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血管抑素基因克隆及在E.coli DH5α的表达

王瑞珉

  血管抑素(Angiostatin,AS)是血浆纤溶酶原(Plasminogen,PLG)经蛋白水解酶降解生成的多肽片段,是直接作用于血管内皮细胞的血管生成抑制剂。AS可以阻抑血管生成治疗由病理性血管形成而导致的疾病,尤其是可通过抗肿瘤新生血管生成抑制肿瘤的生长与转移,有重要的临床应用价值。本研究以高效、低毒、广谱且无耐药性产生的内源性血管抑制因子AS为研究对象,构建含AS基因的分泌型重组表达质粒pEZZ18-AS,在E.coli DH5α内表达并对其进行鉴定。本研究第一部分包括肝组织中总RNA的分离提取;RT-PCR扩增出血管抑素基因。首先,采集术后新鲜肝组织,并于无RNase的条件下分离纯化总RNA。其次,在其完整性及纯度鉴定后做RT-PCR扩增目的基因AS,分别在上下游引物引入限制性内切酶EcoR I与Xba I的酶切位点及相对应的保护碱基。本部分成功获取AS(即Kringle 1-4区域)与PLG Kringle 1-5区(即K1-5)的基因片段。将K1-5 PCR产物测序,结果为:除测序引物后边有一段不稳定序列,其余序列均与Gene Bank里PLG cDNA中相应核酸序列完全相同,无碱基错配、插入或遗漏的出现。第二部分是AS基因分泌型表达载体的构建。用限制性内切酶EcoR I与Xba I对目的基因AS、表达载体pEZZ18行双酶切,酶切产物纯化后利用大肠杆菌T_4DNA连接酶连接构成重组子pEZZ18-AS,并转化E.coli DH5α,经氨苄青霉素LB平板初筛后,以菌液PCR和重组子的单、双酶切行进一步鉴定。随后取通过上述鉴定的重组克隆菌,对重组子插入片段测序,结果为:AS基因开放读码框与表达载体的读码框正确匹配相连,但在其Kringle 4区相当于编码PLG的Lys~(414)密码子AAA的第一位碱基由A突变为G,导致相应的氨基酸残基突变为Glu。天津医科大学硕士学位论文本研究第三部分为重组表达质粒在E coltDH5a中的初步表达与鉴定。将含重组质粒pEZZ18叭S与空质粒pEZZ18的 Ecoli DH5a同时于 AInp”LB液体中培养,当振摇培养的菌液OD。值约为0.5时,于诱导对照管中加入IPTG至终浓度为Inunoffe:继续培养二小时,将离心收集的诱导及未诱导的细菌沉淀进行SDS-PAGE。与空质粒菌比较,重组菌在略小于66kD的标准蛋白处出现一条特异条带,与融合蛋白ZZ-AS分子量理论值6IkD相符。而在重组菌与含空质粒菌经超声碎细胞并离心后,取上清进行ELISA检测,两组所测OD0。值比较,P<0刀 1,差异有统计学意义,说明重组菌里有重组AS表达。本研究成功构建了含AS基因的分泌型表达质粒pEZZ18-AS,并在ECOliDH5a中进行了表达,经SDS-PAGE及ELISA法鉴定重组培养菌内有AS的表达。为以后获得足量AS进行抗肿瘤血管生成的体内外研究奠定了基础。……   
[关键词]:实体瘤;抗血管生成;血管抑素;基因表达;质粒
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:天津医科大学2002年