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人胰岛素原基因转染成纤维细胞及细胞株的建立

王红梅

  用体细胞核移植技术生产转基因动物是目前一种最新、最有效的生产转基因动物的方法,而转基因体细胞系的建立是用这一方法生产转基因动物的基础。本文从绵羊体细胞系的建立、外源基因转染绵羊体细胞、转染细胞株的建立以及细胞的核型分析几个方面系统论述了转基因体细胞系建立的方法,并在实验中对一些技术方法和实验参数进行了摸索和比较,建立了一套较为完善的外源基因转染体细胞及转染细胞株建立的方法。一、绵羊体外培养体细胞系的建立对采集的动物耳部皮肤样品分别采用将组织块剪碎后直接贴附于细胞培养瓶底部的方法和消化液对组织块消化的方法对动物体细胞进行原代培养,前者使得不同品种的绵羊、山羊、牛、北山羊的原代体细胞出现率和可传代率均达到100%。两种培养方法在体细胞出现及可传代的时间上有所差别。对于在体细胞传代培养中出现的上皮样细胞和成纤维样细胞混合生长的问题,根据二者贴壁紧实程度的不同,用0.05%的胰蛋白酶-EDTA对其进行消化,可将两种不同类型的细胞进行分离和纯化。纯化的体细胞经数次传代培养后,进行冷冻-解冻仍具有正常的传代能力。二、人胰岛素原(hINS)基因转染绵羊体细胞系及克隆通过脂质体介导,以BLG-hINS(含乳球蛋白调控基因的人胰岛素原基因)基因作为目的基因、GFP(绿色荧光蛋白基因)基因作为标记基因共转染绵羊成纤维细胞,经适当浓度的G-418筛选三周后,得到转染细胞。消化细胞进行PCR检测,证明筛选出的细胞已成功转染了BLG-hINS基因和GFP基因。对转染的细胞用两种方法进行细胞克隆:一是将极低密度的细胞(50~100个/ml培养液)传入培养皿中,经一段时间培养后,选周围无其他细胞的细胞集落消化后继续培养;二是在显微镜下用检卵针吸取单个细胞放入96孔培养板中培养。两种方法均可得到细胞克隆。选形态正常、生长均匀的5个细胞克隆进行PCR检测,结果为5个克隆均转有GFP基因,其中两个转有BLG-hINS基因。三、细胞的核型分析通过对不同培养代数细胞(成年羊最高为30代,胎羊最高为45代)、转染细胞以及克隆细胞的核型分析,未发现有染色体数目及倍性的异常。因此,从染色体的角度考虑,这些细胞可作为供核细胞。……   
[关键词]:绵羊;体细胞;转染;克隆;核型分析
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:新疆大学2002年
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