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幽门螺杆菌免疫芯片诊断系统的研制

李姁君

  幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)感染世界50%以上的人口,可诱发包括胃炎、胃十二指肠溃疡、胃癌和MLTA淋巴瘤等许多消化道疾病,Hp感染还和许多胃外疾病密切相关。Hp的致病性来源于包括定植力、黏附力和毒性在内的毒力系统,相关研究报道日趋增多和完全,并对cagPAI对CagA的胞内转运及其触发的胃黏膜上皮细胞内信号传递有了新认识。除了Hp毒力系统,感染宿主免疫异质性对感染疾病的转归也十分重要。Hp感染可用抗生素治疗,但是由于耐药性的普遍出现,Hp疫苗的研究已成为当务之急。Hp感染的检测方法目前均为单项指标检测,目的是判明是否感染Hp,蛋白组学分析应该是未来发展的方向。生物芯片(biological chip)技术可在一次反应中进行多种信息的平行分析,主要包含基因芯片(gene chip)和肽芯片(peptide chip)两大类,是利用生物大分子间具有特异相互识别的特点而发展起来的。随着生物芯片检测自动化程度的不断提高,芯片实验室(lab-on-a-chip)的出现成为可能,是包括芯片处理,信号扫描和数据分析的高技术集成系统。肽芯片是由固定于支持介质上的蛋白或多肽构成的微阵列。近来高密度蛋白点阵在免疫学检测中有了不少应用,所使用的固相支持物有玻片、PVDF第四军医大学博十学位论文中文摘要bof们,inylidenedifluoride)膜、ELISA扳等,可进行高通量的定性和定量分析。采用的标记技术大多是在生物分子上偶联荧光物质,这样自动化仪器就可获得芯片片基上反应后的光学信号。胶体金标记技术在检验学中应用广泛,特点是快速,简便,稳定。由于Hp基因组测序己完成,大量报道的毒力相关因子为生物芯片在Hp检测方面的应用提供了基础。我们在本室已克隆表达 cagA基因 5’端 850hp(命名为 CO)基础上,对Hp多种国际标准株cagA基因序列比较并设计3对引物,扩增cagA基因剩余约 2900 hp部分,测序正确后,克隆入 pRSETA His6融合表达载体,在E CO入 BLZI DE3…L*SS冲进行表达,分别得到了HIS6CI、HIS6CZ和His6C3三个cagA截短体重组片段。表达产物的相对分子量分别为37000、28000和42000。用HIS6CI和HIS6CZ表达片段分别免疫新西兰纯种兔,分别获得了抗 CapA两片段 CI和 CZ的多克隆抗体,抗血清的效价均达1:16000,提示所获得的重组蛋白具有较好的免疫原性。CO采用含50mmol/L L精氨酸pH 8刀的复性液4OC稀释复性,在HPLC蛋白纯化系统 Q-H},per D阴离子交换柱纯化,用0二 SM NaCI洗脱杂蛋白,0.35M N沈洗脱目的蛋白,可得到纯度 90%以上的 COHIS6-CI、HIS6-CZ及*拈。*3蛋白变性液在*PLC蛋白纯化系统中亲和层析树脂N厂*TA纯化,用含0.smol、L一’咪g4罗 50mmol.L一’Trs雪10rnmol.L一’NaCI<pHS.0)的iK脱液可有效洗脱HIS。-融合蛋白,得到纯度90%以上的HIS6.CI、HIS6.CZ和 HIS。C土经透析复性后均具有良好活性。用纯化并复性的 CagA抗原片段包被 ELISA a或点 NC膜,建立相应ELISA和 DIGFA法,检测人血清中抗CagA抗体,在正常对照及胃癌病人血清中均可检测到相应抗体,而且阳性率有统计学差异。hstern七lot分析表明,它们均能结合抗Cagh多克隆抗体。纯化的CagA截短体抗原CO以剂量依赖的方式刺激培养人外周血单个核细胞(PBMC)产生TNF-Q;在培养24h时刺激PBMC产主TNF-Q的水平最高;CO不能刺激PBMC细胞产生几-8。CI刺激人PBMC产生TN卜。的水平明显低于m刺激产生h卜。的水平:但*可明显以剂量依赖方式刺激人PBMC细胞产生IL8,而且在培养24h时刺激PBMC产@f研:$NgHgN。@@ iyX,lfoj、R ttfZ1·第四军医大学博士学位论文中文摘要生IL8的水平最高。提示纯化的抗原具有生物学活性,而且表达的HpCagA截短体抗原具有不同的生物学意义。在本室以往工作及上述研究的基础上和软件信息小组一起完成了Hp免疫芯片信息化平台的系绞方案。首先在斑点金免疫渗滤试验(DIGFA)基础上联合以往基因工程技术获得的Hp多种抗原原料建立芯片实验室操作流程,制备出免疫芯片样品,阳性及阴性对照检测性能良好。采用NC膜和胶体金标记技术使芯片实验操作快速、简便、稳定。研究开发了芯片阅读仪,用CCD结合视频采集技术将芯片反应信号转化为计算机可以识别的数字信号。构建数据库及分布体系还有相应网络系统以实现结果分析、存储、交换和信息共享。从而最终建立了Hp检测的综合化信息平台。本室将继续筛选有价值的Hp抗原基因进行基因克隆表达纯化加入免疫芯片以获得更为完整的Hp检测的?……   
[关键词]:阳性率;白细胞介素;ELISA;幽门螺杆菌;免疫芯片
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:第四军医大学2002年