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汉滩病毒核蛋白羧基端多肽真核、原核表达载体的构建、表达及初步鉴定

李光玉

  汉坦病毒属布尼亚病毒科,它所引起的肾综合征出血热(HFRS)和汉坦病毒肺综合征(HPS)是一类以发热、出血、肾损害或肺损害为主要临床特征的急性传染病。该病的疫源地遍及世界五大洲,我国是世界上受其危害最为严重的国家,年发病人数占世界总数的90%以上,近10年来年发病人数仍保持在4~6万,居高不下,严重危害人民的生命健康。已知致病的汉坦病毒(Hantavirus,HV)主要有5种型别,包括汉滩病毒(HTNV)、汉城病毒(SEOV)、多布拉伐病毒(DOBV)、普马拉病毒(PUUV)和辛诺柏病毒(SNV)。我国目前流行的汉坦病毒为前两型,即HTN型和SEO型。由于两型病毒的动物宿主、流行特点和所引起的临床疾病轻重明显不同,对其进行分型检测非常重要。自20世纪70年代中期成功分离汉坦病毒后,对该属病毒或血清标本的分型检测一直依赖空斑减少中和试验(PRNT),出于汉坦病毒在体外传第四军医大学硕土学位论文代细胞中生长缓慢,PRNT不仅需时长(通常需要10天以上时间),而且对实验材料的要求较高,普通医疗单位难以开展。90年代中期发展了汉坦病毒的反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)和测序分型技术,该方法操作复杂,实验成本较高,不适合在临床实验室和流行病学现场常规使用。国内多年来广泛采用的血凝抑制试验虽然具有简便快速的优点,但进行分型检测时,相当数量的HTN或/SEO型病毒感染者(或实验动物)的血清标本血抑效价非常接近,难以进行准确分型。因此,迫切需要研究和开发新的简便快速的分型检测或分型诊断方法。汉滩病毒和汉城病毒的核衣壳蛋白约由430个氨基酸组成,对不同型别汉坦病毒的同源性分析表明,NP不同区段氨基酸的一级结构有很大差异,其中N100(邻近氨基末端的100个氨基酸)、N210-330(第210~第330位氨基酸)和C100(邻近梭基末端的100个氨基酸)3个部分中,CI 00 同源性最高,即最保守,这与其功能相一致(是病毒RNA 的结合区);同源性最低的区域是NZ 10-330,即这一区域是NP的高度变异区;N100同源性也较高,其亲水性较强,是NP主要的抗原结合区。上述研究结果提示,体外表达NP蛋白的高变区,有可能用于汉坦病毒的分型检测研究。近年国外的研究也表明,原核或真核表达的截短的NP(如155-429aa),可用于血清学分型检测试验。基于以上研究思路和结果,我们尝试进行了汉坦病毒梭基端截短NP的真核和原核表达。首先构建了含HTNV76刁 株S基因及其3’端825hP的真核表达载体P。DNA3.l七及P。DNA3.Is{,然后将真核表达载体pcDNA3.l-S及pcDNA3.l-S-C通过脂质体转染至Vero细胞,并用IFA成功检测到目的基因在Vero细胞中的高效表达,表达的NP及其梭基端多肋显示了良好的抗原性,为探索分型抗原和建立快速简便的分型方法奠定6第四军医大学硕士学位论文了基础。为了获得便于大量制备纯化的抗原,本研究在真核高效表达 HTNV NP竣基端155-429aa的基础上,进一步构建并鉴定了含 HTNV76-118株 S基因及其3’端825hP的原核表达载体PRSETA*及PRSETA-C,期望得到高效表达并获得和真核表达多肽一样良好的抗原性。将原核表达载体PRSETA七及PRSETA-C分别转化表达菌BLZI(DE3)PLySS并对它们 进行/了诱导表达,SDS-PAGE显示获得了与6HIS和信号识别肽融合的表达蛋白,明显表现为不溶状态(包涵体),其分子量分别为55KD和35KD,与预期分子量一致。应用lestern blot进行初步检测,显示其抗原性很弱,进一步的抗原性分析正在进行中。本研究结果提示,真核表达的HTNV截短NPW基端多肽门—429aa)显示出良好的抗原性,可作为抗原用于IFA并进一步用于建立分型诊断方法;原核表达中,HTNV截短NP梭基端多肽(155—429aa)得到了高效表达,但其确切的抗原性尚需进一步研究分析。……   
[关键词]:汉滩病毒;S基因;核衣壳蛋白;多肽抗原;基因克隆;真核表达;原核表达
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:第四军医大学2002年