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鱼类几种免疫相关基因的克隆与鉴定

金红建

  为了克隆草鱼免疫相关基因,我们构建了草鱼白细胞cDNA文库,同时对利用生物信息资源快速鉴定鱼类新的功能基因的方法进行了初步探讨,为今后深入开展鱼类功能基因研究奠定了良好的基础。本文第一部分取病毒感染36小时后的草鱼头肾并分离白细胞,用改进的异硫氰酸胍一步法从其中提取总RNA,磁珠法分离纯化mRNA,电泳检测其质量。经逆转录合成双链cDNA,经过分离柱除去小片段DNA后重组入噬菌体λgt10载体中,转染宿主菌C600hlf,文库包装效率为4.2×10~7pfu/ug,cDNA插入片段大小在0.4~3kb之间。用PCR方法筛选文库,获得了草鱼干扰素(Interferon,IFN)基因的部分序列。研究表明,所构建的文库质量较高,可以广泛用于草鱼免疫相关基因的表达和调控研究。本文第二部分利用计算机表达序列标签(expressed sequence tag,EST),TIGR Gene Index等数据库进行综合搜索分析,快速鉴定了鱼类两种新的功能基因:QM和NKEF基因,并对获得的cDNA全序列进行了分析。最后,根据拼排的NKEF基因的开放阅读框架(Open Reading Frame,ORF)的保守区设计特异引物,经PCR反应(在100μl反应混合液:200mM dNTPs,1.5mM MgC12,10ml 10×buffer,0.2mM ptimer,1单位Taq DNA polymerase中进行,反应温度和时间条件是94℃30秒,55℃30秒及72℃1分钟,40个循环后琼脂糖凝胶电泳检测),从文库中扩增到草鱼NKEF基因ORF的300bp长度的cDNA片段。……   
[关键词]:草鱼cDNA文库;鱼类免疫功能基因;表达序列标签;计算机克隆
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:浙江大学2002年