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天南星科植物病毒研究

李永伟

  本研究论文对我国浙江省、湖南省和海南省等地的天南星科植物上的主要病毒进行了检测和分子鉴定,比较了该科主要病原病毒芋花叶病毒(DsMV)不同分离物的序列同源性并分析其种内分化关系;同时,我们对2种重要的芋属栽培作物——奉化芋艿头、乌梗芋(Colocasia esculenta)和我国特有的天南星科药用植物——掌叶半夏(Pinellia cordata)进行了脱毒培养和快速繁殖研究。获得以下研究结果。用侵染马蹄莲的DsMV 3′末端序列和黄瓜花叶病毒(CMV)的亚基因组启动子区互补DNA序列为标记探针,对自然感病的天南星科植物进行RNA斑点杂交,并结合双链RNA分析、病毒提纯和形态学观察,对杭州等地16属天南星科植物的81个样品进行了病毒鉴定。结果表明:DsMV普遍侵染Aglaonema, Alocasia, Anthurium,Anadendum, Arisaema, Colocasia, Calla, Dieffenbachia, Epipremmum, Monstera,Pinellia, Philodendron, Typhonium和Zantedeschia等14属植物;其中Epipremmum,Calla, Typhonium为DsMV的新寄主。我们还首次在Aglaonema, Alocasia, Arisaema,Colocasia, Calla, Philodendron和Epipremmum等属植物上检测到DsMV和CMV复合侵染现象。在所有81个样品中,DsMV单独侵染占总数的56.79%,DsMV和CMV复合侵染占总数的24.72%,CMV单独侵染占总数的1.23%。以上结果显示:DsMV是杭州等地的天南星科植物的最主要的病毒病原,CMV也是该科植物上的重要病毒病原。同时,DsMV和CMV形成复合侵染的情况存在明显的地域差异。来自我国热带地区海南省的样品中,DsMV和CMV复合侵染占总样品数的62.5%,湖南省的样品其次,占总数的41.7%,来自浙江省的样品为10.87%。通过提取感病组织中的病毒RNA并进行RT-PCR扩增,获得了3个DsMV分离物的3′末端cDNA。序列分析表明:3个芋属作物来源DsMV的3′-末端存在序列同源性差异。来自浙江东阳的DsMV-DY1的3′-末端序列(1265 nt),包含1008 nt的CP基因和257 nt的3′-末端非编码区(3′-UTR);来自浙江东阳和浙江杭州的DsMV-DY2和DsMV-FH的3′-末端序列(809nt和822nt)分别由560nt和574 nt的CP基因、249 nt和248 nt组成的3′-UTR序列组成。与8个国内外现有报道和Genbank收录的同源序列进行同源性比较的结果显示:DsMV的CP的核苷酸序列和氨基酸序列以及3′-UTR核苷酸序列的长度和序列同源性均有较大差异。DsMV-DY1分离物与其它分离物的CP核苷酸序列同源性仅为76~83%,氨基酸序列同源性为79~85%,3′-UTR核苷酸序列同源性为66~73%,已经接近植物病毒区分“种”的最低限度。DsMV-DY2分离物与其它分离物的CP核苷酸序列同源性为89~92%,3′-UTR核苷酸序列同源性为67~93%。DsMV-FH分离物与其它分离物的CP核苷酸序列同浙江大学硕士学位论文源性为81~90o,3’-UTR核苦酸序列同源性为70~95O。DSMV的CP核昔酸序列和氨基酸序列及了-UTR核昔酸序列进行系统进化树分析表明,其序列的差异难以与地理分布或寄主植物的差异联系起来。DSMV的CP核昔酸序列和氮基酸序列进行系统进化树分析表明:来自浙江东阳的芋分离物DSMV-DYI与来自日本的芋分离物DSMV-DK形成相对独立的一类,而来自浙江东阳的芋分离物**MV0YZ和来自浙江杭州的芋分离物*sMV fH与其它分离物形成独立的一类。不同DSMV分离物3’-UTR核苦酸序列进行系统进化树分析表明:DsMV-DYI和英国获得的Dioscorea分离物DeSLKZ形成相对独立的一类,而芋分离物未自浙江东阳的芋分离物kMV-**2和来自浙江杭州的芋分离物* MVMV-*H与其它分离物相对成簇。采用芋顶芽、腋芽和茎尖作为外植体,结合高温消毒法,进行了我国特色芋头—一奉化芋芳头和乌梗芋的脱毒培养和快繁技术研究。外植体经自来水冲洗、75%酒精浸泡o dll)、饱和漂白粉浸泡O Inn)和 0l%升汞浸泡灭菌厂 min)后,用无菌水仲洗(四次以上)进行固体培养,其污染率约为 10%。外植体在 MS+2 m叭 6-BA+3%蔗糖+0.7%琼脂的培养基中形成不定芽,将不定芽转移至MS+3%蔗糖+0.7%琼脂的生根培养基中,形成完整的小植株。在芋组培苗生根时期,用外源植物激素三十烷醇(TA)处理 23 d后测定植株生物量。0.5 ppm* TA浓度处理的芋组培茵的株高、根数、最长根长和鲜重高于对照o<0刀 1卜 而5ppm、10ppmTA处理的芋组培苗植株生物量低于对照(P<0.01卜以上结果表明:0.5ppm、lppmTA处理将促进芋组培苗的生长,而5ppm、10 ppmTA处理将抑制芋组培苗的生长。以DSMV基因组和 CMV基因组RNA的 cDNA探针,分别对奉化芋芳头和乌梗芋组培苗进行了 DSMV和CMV检测。结果表明,核酸杂交可以检测到约50 pg的DSMV的基因组RNA,经过高温和茎尖培养处理,约10%的组培苗已无DSMV和CMV侵染。本研究分别获得了奉化芋芳头和乌梗芋的脱毒苗。?……