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AmpC酶和ESBLs介导的阴沟肠杆菌耐药

佘丹阳

  【目的】 1)了解AmpC酶和不同基因型ESBLs在临床分离阴沟肠杆菌中的流行情况;2)尝试建立适合临床应用的检测高产AmpC酶阴沟肠杆菌的方法;3)探讨AmpC酶和ESBLs表达对阴沟肠杆菌耐药特性的影响;4)比较哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦、头孢他啶、头孢噻肟、头孢吡肟和亚胺培南对阴沟肠杆菌高产AmpC酶突变的选择能力;5)研究Thr70突变对阴沟肠杆菌AmpC酶功能的影响。【方法】 1)利用常规纸片扩散药敏试验从我院临床分离的106株阴沟肠杆菌中筛选出对第三代头孢菌素或氨曲南敏感性减低的菌株,采用三维试验、等电聚焦电泳、接合试验、PCR扩增ESBL基因以及DNA测序等方法对耐药菌株的AmpC酶和ESBL表达情况进行检测,并用ERIC-PCR分型方法分析耐药阴沟肠杆菌的流行特征;2)以头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松和氨曲南纸片为指示纸片,以氯唑西林(50ug/纸片)为酶抑制剂,按照加氯唑西林后指示纸片抑菌环直径增加5mm或5mm以上为高产AmpC酶阳性标准,对108株阴沟肠杆菌进行检测(含2株标准菌株),与三维试验和等电聚焦电泳结果对照;3)采用琼脂稀释法检测16种抗生素对106株阴沟肠杆菌的MIC,分析产酶情况不同的菌株在耐药表型方面的差异;4)以10株单纯诱导产酶菌和5株单纯产ESBL菌为选择对象,以哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦、头孢他啶、头孢噻肟、头孢吡肟、亚胺培南为选择抗生素,采用肉汤稀释渐进突变选择法筛选耐药突变株,用三维试验监测受试菌的AmpC酶产生情况,用琼脂稀释法测定第三代头孢菌素、头孢吡肟和亚胺培南对耐药突变株的MIC;5)PCR法克隆野生型ampC基因,PCR定点突变法在野生型ampC基因上构建点突变,使野生型AmpC酶的Thr70分别突变为Ⅱe、Asn和Ser,获得三种突变型AmpC酶,琼脂稀释法测定抗生素对产野生型或突变型AmC酶的重组菌的MIC,紫外分光光度法测定野生型或突变型AmC酶对 fi-内酚胺抗生素的相对水解率。匹MWe3)106株阴沟肠杆菌中,诱导产酶定性试验阳性菌68株(64.2%),单纯高产AmpC酶菌门株(16.0%),单纯产ESBLs菌11株(10.4%),高产AmpC酶的同时产ESBLs菌14株门.2%)。ESBLS 的基因型以CTX-M-3型最为常见,占全部产ESBLS菌株的72.0%(18/25),SHV-12型占 28.0%(7/25);ERIC-PCR指纹图谱显示,17株单纯高产APPC酶的阴沟肠杆菌由17种不同的克隆构成,11株单纯产ESBLS的阴沟肠杆菌由11种不同的克隆构成,14株同时高产AmPC酶和ESBLs的阴沟肠杆菌由8种克隆构成。2)单用头抱他唆、头抱捌亏、头抱曲松或氨曲南进行双纸片氯哩西林增效试验时,敏感率分别为90.6%、朋.8%、65.6%。59.弧;联用头抱他睫和头抱噬肪(或头抱曲松)进行双纸片氯哇西林增效试验时,敏感率达到了100%;无论使用何种指示剂,76株非高产AmpC酶茵株的双纸片氯哩西林增效试验结果均为阴性。3)对全体受试菌而言,氨书西林/舒巴坦和头抱西丁的耐药率最高,均在90%以上,三种碳青酶烯类抗生素的耐药率最低,均为0;单纯高产AmPC菌株对第 H代头抱菌素的耐药率均在70%以上,对吸拉西林/他唆巴坦和头抱吸酮/舒巴坦的耐药率也在50%以上,除碳青酶烯类抗生素外,敏感率较高的抗生素为头抱毗躬(100O)、阿米卡星(94.12O)、庆大霉素(70.59O)和环丙沙星O6.47%);单纯产ESBLS菌株对第三代头抱菌素的耐药率均在50%以上,对庆大霉素和环丙沙星的耐药率高达81.82%和72.73%,敏感率较高的药物为吸拉西林/他哩巴坦(72.73%)、头抱吸酮/舒巴坦(63.64%)和阿米卡星(8182%);同时产ESBLs和高产AmpC酶的菌株对除碳青酶烯类抗生素以外的其他药物的敏感率均在25%以下。4)在单纯诱导产酶的野生型阴沟肠杆茵中,头抱他陡和头抱唆肪显示了最强的选择高产AmpC酶突变的能力,派拉西林/他哩巴坦和头抱呢酮/舒巴坦选择高产AmpC酶突变的能力略逊于头抱他睫和头抱噬Bh,头抱毗肪选择高产A。pC酶突变的作用较弱,由头抱他陡、头抱噬胎、呢拉西林/他陛巴坦和头抱吸酮/舒巴坦选择产生的耐药突变株均具有高产AmmC酶菌株的典型耐药表型;在单纯产ESBLs的阴沟肠3杆茵中,吸拉西林/他唆巴坦选择高产AmpC酶突变的能力明显强于头抱他陡和头抱噬躬,头抱……   
[关键词]:AmpC酶;阴沟肠杆菌;抗生素;耐药性;突变;ESBLs
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国人民解放军军医进修学院2002年