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TGF-β类生长因子基因的克隆表达及在基因治疗中的应用

孙大铭

  TGF-β类生长因子是一类具有广泛生物学活性和重要临床应用价值的细胞因子,包括多种蛋白因子,它们在氨基酸结构上具有不同程度的同源性,共同构成了TGF-β超家族,包括BMPs、活化素、抑制素和缪勒氏物质等。近年来,人们对TGF-β类生长因子与骨修复的关系进行了广泛的研究,证明TGF-β类生长因子能通过化学趋化作用使间充质干细胞聚集,促进其增殖并向成骨方向分化,从而起到促进骨形成的作用。在众多的TGF-β类生长因子中,TGF-β1、BMP2和BMP7因其较强的成骨能力而受到密切的关注。基因工程重组蛋白的应用和基因治疗是TGF-β类生长因子应用中的两种重要的策略。本研究从TGF-β1、BMP2和BMP7基因的克隆和鉴定入手,利用基因工程的方法,在大肠杆菌中表达TGF-β1,制备了具有生物活性的TGF-β1,同时构建了BMP2和BMP7真核表达质粒以及TGF-β1、BMP2和BMP7的重组腺病毒,体外分离培养了骨髓间充质干细胞,通过间接转移技术(ex vivo)和直接转移技术(in vivo)对TGF-β1、BMP2和BMP7在基因治疗中的应用进行了初步研究。本研究由四部分组成。1.TGF-β类生长因子的克隆以pMAM-TGF-β1为模板,通过PCR技术扩增得到TGF-β1成熟肽基因片段;利用人类骨肉瘤细胞MG63和人胚胎肾细胞HEK293,通过反转录PCR技术扩增得到了BMP2和BMP7的全长cDNA。将上述三种基因片段插入到pGEM-T载体,构建成pT-TGF-β1、pT-BMP2和pT-BMP7克隆质粒,酶切鉴定和序列分析证实所克隆的TGF-β1、BMP2和BMP7基中文槽耍因与预期结果一致。三种基因的克隆为重组蛋白的制备和基因治疗的研究奠定了良好的基础。二.TGF.PI在原核细胞中的表达基因工程技术是大量获得TGF-p类生长因子的重要方法,我们构建了TGF-pl的融合表达和非融合表达质粒,并在大肠杆菌中得到了高效表达,通过蛋白纯化和复性技术,得到具有生物活性的TGF BI,细胞测活实验证实,重组TGF-pl具有良好的生物学活性。3.TGF-p类生长因子真核表达质粒的构建及在骨眩间充质干细胞中的表达在获得pMAM-TGF-pl真核表达质粒的基础上,把BMPZ和 BMP7基因成功地插入了真核表达载体pCDNA3二,构建了pCDNA-BMPZ和pCDNA-BMP7真核表达质粒。成功地分离和培养了骨髓间充质干细胞,并对其进行鉴定,结果表明间充质干细胞的纯度在95%以上。利用TGF.BI和BMP7的真核表达质粒对间充质干细胞进行转染,成功地得到了能够稳定表达 TGF6和 BMP7的间充质干细胞,为基因治疗奠定了良好的基础,同时也为骨组织工程的研究提供良好的种子细胞。4.TGF.p类生长因子的重组腺病毒制备和异位诱导成骨的研究将 TGF-61、BMPZ和 BMP7的基因克隆到转移载体 pAdTrackCMV中,通过在细菌BJSI 83中与pAdEasy腺病毒基因组进行同源重组,得到了 TGF-pl、BMPZ和 BMP7重组腺病毒的基因组。通过转染HEK293细胞包装出重组腺病毒。利用BMPZ重组腺病毒在裸鼠体内进行异位诱导成骨实验,实验证明,BMPZ重组腺病毒能够成功地诱导异位骨形成。通过上述一系列实验,我们获得了 TGF6高效表达的大肠杆菌的工程菌株,建立了TGF-pl蛋白复性和纯化的方法;成功地克隆了BMPZ和BMP7的全长CDNA,构建了 BMPZ和 BMP7的真核表达质粒和 TGF.pl、BMPZ和BMP7的重组腺病毒;成功地分离和培养了高纯度的骨髓间充3中文扬要质干细胞;对TGF-p类生长因子的基因治疗进行了初步的研究。这些工作为TGF D类生长因子的研究和应用奠定了坚实的物质基础。……   
[关键词]:转化生长因子-β;骨形成蛋白;骨髓间充质干细胞;基因工程;组织工程;骨形成;基因治疗
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国人民解放军军医进修学院2002年