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中国蟋蟀总科昆虫RAPD分析研究

李恺

  RAPD(随机扩增多态性DNA)技术是二十世纪90年代发展起来的一项DNA分子多态性检测技术,它建立于聚合酶链式反应(PCR)技术基础之上,利用随机合成的寡聚核苷酸序列为引物(一般为10个bp),分别与DNA的两条单链结合,在DNA聚合酶的作用下,对基因组的特定区域进行PCR扩增,其电泳结果为不同大小和数目的DNA谱带即RAPD图谱,可反映基因组相应区域的DNA多态性。RAPD技术可在对物种没有任何分子生物学研究的情况下对其进行DNA多态性分析,有助于系统学研究中广泛进行物种间比较。大量的研究表明RAPD具有个体、群体、亚种、种等各水平的特异性,并且是按孟德尔方式遗传的,因而是一种优良的遗传标记。由于该技术高效、快速,对材料的要求不高,取材少、成本低,又无需分子生物学背景且操作简便,所以一出现就被昆虫学家所认可,并广泛的应用于分类学及系统发育研究。但是,目前的研究主要集中于一些与人类生活关系较为密切的种类(如蚊、蝇、蚜虫等),其它昆虫的研究相对较少。国内应用RAPD技术于昆虫系统学研究则更滞后。蟋蟀隶属于昆虫纲(Insecta)直翅目(0rthoptera)长角亚目(Endifera)蟋蟀总科(Gfylloidea),是人类常见的昆虫类群之一。早在一千多年前,蟋蟀就因能发出动听的鸣声而引起人类的注意。目前,全世界已知约490多个属、3500多种,我国蟋蟀总科昆虫已知约64属、200多种。这类昆虫中,许多种类是著名的娱乐观赏昆虫,有些种类对农林业造成严重危害,与人类有着密切的关系。然而对蟋蟀的系统学研究还很不完善,传统的形态分类目前仍是其系统学研究的主要方法,而蟋蟀类昆虫近缘种现象较为普遍,在许多方面,学者的观点不一,争议也较大。近代新技术在蟋蟀系统学研究上应用的主要有发音和细胞学方法,分子系统学方面的研究较少。蟋蟀总科的分子系统学的研究也主要集中在个别种种内或种间mtDNA多态性方面及个别种同工酶的研究上,而利用RAPD技术进行蟋蟀基因组DNA多态性方面的研究在国内外更少,国外仅见Chu,J.等(1995)利用RAPD标记区分美国东部一杂交地带的蟋蟀的两个姐妹种,Allonemobius Fasciatus和A.socius,并于1998年使用RAPD和异型酶标iC做出了这两种蟋蟀的基因连锁图;国内田英芳、郑哲民(2 0 of)首次将RAPD技术运用于蟋蟀总科的分子系统学研究中,采用2种引物对7种蟋蟀进行了基困组DNA多态性研究,并应用UPG问A法构建树状图,椎测系统发生关系.本项研究在依据外部形态分类鉴定及前人工作的基础上,采用RAPD技术,通过对蟋蟀总科7科26属57种蟋蟀基因组DNA的RAPD图谱的比较研究,在分子水平上探讨这些类群的分类地位和亲缘关系,为丰富蟋蟀总科的分子系统学研究,并为进一步完善蟋蟀总科的分类系统,揭示其系统发育及演化提供分子水平的依据。本研究经用5 4种随机引物对5 7种蟋蟀的RAPD扩增分析得出以下结论:1)采用RAPD技术,首次较系统地对中国蟋蟀总科7科2 6属共5 7种蟋蟀进行了系统学研究。在所试用的54种随机引物中筛选出可扩增出清晰可辨且稳定的RAPD图谱的引物分别为:蟋蟀科 9种、岭蟋科 9种、树蟋科12种、结蟋科12种、蛛蟋科13种、铁蟋科13种、貌蟋科13种。这其中有7种引物:SS、583、5142、550、555、561、5379可通用于蟋蟀总科 7科不同种类的 RAPD扩增,其中S 8、SI4 2、S 8 3、S 5 5这4种引物可用来鉴别蟋蟀的性别。2)在提取蟋蟀总科昆虫的基因组DNA时,比较了CTAB法和蛋白酶K法两种方法,结果显示蛋白酶【法更适用于蟋蟀总科昆虫的基因组则A的提取。3)蟋蟀同种不同个体、不同性别的RAPD扩增聚类分析结果显示,同种的不同性别先各自相聚,然后同一种的再聚在一起,这说明,同种不同性别和不同个体之间存在不同程度的差异,但性别差异及个体差异均小于种间差异。4)蟋蟀同种不同个体、不同性别的聚类分析结果显示,同种的不同性别各自相聚且明确区分,说明所选用的弓】物与基因组DNA结合位点的染色体恰好位于性染色体上,困而能把同种的不同性别清楚地区分开.由此,可以得出:只要选用适当的引物,RAPD技术可被用来鉴别物种的性别。5)RAPD是研究蟋蟀总科昆虫系统学的一种优良的分子标i己,在研究个体间、属内种间乃至近缘属间的亲缘关系时都具有广泛的适用性,但对亲缘关系较远的属其应用受到很大的限制;同时,RAPD技术能很好的解决蟋蟀总科许多种类雌性难以区分的问题。6)蟋蟀科油葫芦属、斗蟋属、棺头蟋属三个属的属内聚类分析结果所呈现的属内种间关系与传统方法所得的结果基本一致,且结果支持黄脸油葫芦、黑卜脸油葫芦为独主种的观点。另外,整个蟋蟀科12属的聚类分析结果显示,这i……   
[关键词]:RAPD;直翅目;蟋蟀总科;中国
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:陕西师范大学2002年
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