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簇毛麦抗白粉病基因的染色体显微切割及其抗病相关基因克隆的研究

孔凡晶

  小麦白粉病是影响我国小麦生产的主要病害,培育抗病品种是防治病害的经济有效的途径;而抗病基因的研究则是抗病育种的基础。目前,已定名的抗小麦白粉病基因有29个位点,45个主效基因,并已进行了染色体定位及找到了相应的分子标记,但仍没有一个抗病基因克隆成功。本研究以引自原苏联的簇毛麦为白粉病抗源选育的6D/6V代换系RW15为供试材料,以染色体显微切割技术为主线,进行6V染色体上抗白粉病基因的克隆,主要研究内容是:创制6VS单端体、双端体异代换系材料;构建、筛选6VS特异文库;利用已克隆抗病基因的保守域设计引物,从6VS端体扩增抗病基因同源序列;构建小麦-簇毛麦易位系的cDNA文库,并以抗病基因同源片段为探针对文库进行筛选,获得如下主要结果:1.利用组织培养、抗病性鉴定、细胞遗传学分析和原位杂交获得了6VS/6D单端体、双端体异代换系H1-2和H1-2-6。2.采用玻璃针显微切割、“单管”技术体系及LA-PCR,构建了6VS DNA特异质粒文库。文库含有17000个重组克隆,插入片段长度从100-1500bp,平均600bp;63%的插入序列克隆为单/低拷贝,37%为多拷贝。3.从文库中筛选到5个多拷贝簇毛麦专化序列pHVMK134、pHVMK137、pHVMK125、pHVMK130和pHVMK67。3个簇毛麦专化单拷贝序列pHVMK22、pHVMK15和pHVMK129。其中,pHVMK22可以作为探针在小麦遗传背景下进行簇毛麦抗白粉病基因的检测。4.利用已克隆抗病基因的保守域设计了7对引物,从6VS端体DNA中扩增出10类抗病基因同源片段Hvrgak1-Hvrgak10(GenBank登录号为AF387113-AF387120,AY040671,AY040672)。抗病同源序列与小麦抗白粉病基因的连锁分析表明,Hvrgak2、Hvrgak4和Hvrgak5与抗病基因相关。5.构建了小麦-簇毛麦易位系的cDNA文库,克隆载体为λZAP。文库滴度为3.5×10~5,插入片段0.4-4.3kb,平均1.8kb。6.从cDNA文库的1.2×10~6个克隆中经两次筛选获得四个阳性克隆:kong1插入片段2.9kb;kong28,插入片段1.3kb;kong32,插入片段1.2kb;kong36,插入片段1.1kb。对这些插入片段的Southern分析表明均为阳性。7.利用差异显示技术共获得10个差异。DNA片段,有两个Northern分析为阳性。序列分析表明,R3习为 840hp,在 GenBank中没有发现同源性较高的植物基因序列;8CI.36为 587hp,同玉米的 tbl基因*七8区段有 100%同源性,与sphenostylisstenoc地aIll类几丁质酶基因15-56区段有100%同源性。……   
[关键词]:簇毛麦;普通小麦;抗白粉病基因;染色体;染色质;DNA;异代换系;抗病基因;抗病相关基因
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国农业科学院2001年