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黑暗链霉菌S.tenebrarius H6中与抗生素有关生物合成基因的克隆

李天伯

  链霉菌S.tenebrarius H6产生氨基糖甙类抗生素[阿普霉素(Apramycin,Am)、妥普霉素(Tobramycin)及卡那霉素B(KanamycinB)]。为了研究其菌体内抗生素生物合成基因,首先建立该菌株的完整基因文库。提取S.tenebrarius H6总DNA,经不完全酶切、蔗糖梯度离心,收集得到20~30kb片段连接入柯斯载体pKC505。噬菌体蛋白体外包装、转导大肠杆菌E.coliDH1,随机挑取2880个的转化子以单克隆保存于-70℃ 30个96空板中。经检测,文库覆盖率达到99.9%。为寻找合适的探针基因筛选文库,首先尝试利用链霉素产生菌Streptomyces griseus中StrE、StrD、StrO基因与S.tenebrarius H6总DNA进行Southern杂交,未见阳性信号。根据链霉菌内多种同源基因的保守性,参考已发表的14种链霉菌中与己糖次级代谢有关的dTDP-葡萄糖-4,6-脱水酶序列,经Alignment比较分析,取同源性最高的两片段设计引物,以S.tenebrarius H6总DNA为模板PCR得到了该菌株自身dTDP-葡萄糖-4,6-脱水酶的部分基因0.6kb片段。以此片段为探针,通过菌落原位杂交筛选整个文库得到30个阳性克隆。通过进一步的酶切分析、Southern杂交,将30个克隆排列定位,得到了与探针连锁的约50kb基因。经测序、ORF分析及同源性比较,证明已从链霉菌S.tenebrarius H6中克隆了完整的dTDP-葡萄糖-4,6-脱水酶基因,共1132bp命名为aprE送交GENEBANK,accession No.AF306787。同时,部分测序结果表明此基因两端的序列已连锁了其它次级代谢生物合成的结构基因,其中一端与链霉素生物合成有关的dTDP-4-脱氢鼠李糖还原酶基因显示出了较高的同源性。黑暗链霉窗S.亡enebraajus H6中与抗生素有关生物合成基因的克隆中文嫡g将覆盖 50kb连锁基因簇的三个柯斯质粒分别转化Slividans TK24。在异源系统中进行联合共培养,发酵产物未显示出抗菌活性。……   
[关键词]:链霉菌;基因文库;dTDP-葡萄糖-4;6-脱水酶;糖生物合成基因
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:沈阳药科大学2001年