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酪氨酸羟化酶基因转染神经干细胞及表达

邱克军

  帕金森症(Parkinson s disease,PD)的基本病理改变为中脑黑质多巴胺能神经元进行性坏死,同时神经元内多巴胺合成代谢过程中的限速酶——酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)含量下降,其结果导致纹状体区多巴胺含量的显著减少,引起各种临床症状。目前PD的非手术治疗,以补充多巴胺合成的前体物质左旋多巴(L-3,4-dihydroxyphenylalanine,L-dopa)为主,但随着疾病的发展,存活的多巴胺能神经元及其酪氨酸羟化酶含量进一步下降,即使补充大量各类药物,也难以达到满意疗效。因此,有效地增加纹状体区多巴胺能神经元的数量,增强神经元合成多巴胺神经递质的能力,是治疗PD的关键措施。在脑纹状体内移植多巴胺能组织,以提高脑内多巴胺神经递质的含量,正发展成为一种新的治疗方法。脑内移植胚胎中脑组织治疗PD的效果得到广泛确认,但是这种方法也存在一定的局限性,首先要同时获得数个胎龄相似的用于脑内移植的胚胎非常困难,其次在伦理学上也存在激烈的争论,在很大程度上限制了这种方法的广泛应用。为了增加纹状体多巴胺的含量,研究者们将成纤维细胞、成肌细胞等经基因工程改造使之表达酪氨酸羟化酶移植到纹状体内,增加多巴胺递质的含量,以达到治疗PD的目的,但是这一类非神经源性细胞不能在宿主脑内长期存活,不能与宿主脑神经发生神经整合,作用时间较短,效果仍不理想。因此,寻找一种既能与宿主脑发生神经整合,在宿主脑内长期存活,又易于获得,易于在体外培养增殖,便与进行基因操作,表达酪氨酸羟化酶的的细胞供体源,用于脑移植治疗PD将有重要的意义。自90年代初以来,学者们在对神经发育的研究中发现一类广泛存在于哺乳动物CNS的未分化细胞。这类细胞具有自我分裂,自我复制,自我更新及自我维持的能力,并具有多种分化潜能,研究者认为这一类细胞属于神经干细胞(NeUral Stem cells,NSCs)。神经干细胞可在体外培养,长期传代,大量增殖,在体外诱导因子的作用下可以分化发育为成熟的各种神经细胞表型,尤其是分化成熟的神经元具有完整的电生理功能,脑内移植后能长期存活,并与宿主脑细胞之间产生神经整合,建立起复杂而广泛的突触联系。由于NSCs易于获得,在体外增殖迅速,便于进行基因工程操作,是基因治疗CNS疾病的理想载体细胞。本研究中,我们从胚胎16天(Emb仰oicday 6,EI6)V让tar大鼠前脑室管膜下周围区分离、鉴定、培养增殖了神经干细胞c同时,我们将缺陷性逆转录病毒载体NZA与多巴胺合成的限速酶基因TH一起构建了表达质粒,然后将该表达质粒转染PA3 I7细胞,收集经PA3I,包装产生的含TH-NZA具有感染能力的逆转录病毒颗粒。并将收获的h-NZA病毒感染体外培养的神经干细胞,诱导其分化后,用免疫荧光细胞化学的方法检测到了TH基因在分化细胞内的表达。实验结果如下:1.构建并扩增Th-NZA表达质粒。2.分离、鉴定、大量增殖和搜集了EI6Wstar大鼠前脑室管膜下周围区的NSCs。3.建立了TH-N止转染NSCS的有效方法,探索了逆转录病毒表达质粒转染NSCS的最佳条件。4.以不同的条件在体外诱导NSCs分化为神经元和神经胶质细胞,验证了所分离的NSCS具有多分化潜能c5.证实了转染TH-N。A的NSCS分化为神经元及胶质细胞后都能有效地表达TH,并且,NSCS的神经生物学特征不因TH-N。A的转染而发生变化。总之,本实验成功地进行了NSCs的分离、鉴定及体外培养,并完成了重组逆转录病毒载体质粒N。A-TH对NSCS的转染,证实了TH在分化细胞中的表达,我们认为可在体外培养,大量扩增,并容易进行h基因转染,且能表达TH的NSCs可以作为脑内细胞移植治疗PD的供体源。……   
[关键词]:神经干细胞;酪氨酸羟化酶;基因工程;帕金森病
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:第三军医大学2001年