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家蝇早期胚胎转基因前后的差异表达研究

江禹

  在转基因动物研究中,进入宿主细胞的外源基因会受到细胞本身调控机制的作用,这个过程影响了外源基因的去向——整合或消失。为了证实细胞的这种变化,我们以转基因处理的家蝇卵为研究对象,利用银染差异显示技术(DD-PCR),对携带绿色荧光蛋白(GFP)和抗菌肽(ABP)融合基因的真核表达载体以电转移的方式导入家蝇受精卵后,卵内基因的表达情况做了研究。首先比较了模板用量,MgCl_2及dNTP的浓度对DD-PCR的影响,优化了反应条件,建立了以家蝇卵为模型的银染DD-PCR方法。实验结果为:1.反转录(RT)反应中总RNA的用量为3μg和6μg,对最终的差示结果不会产生明显的影响;2.采用PCR专用薄壁离心管,MgCl_2浓度为2.0mmol/L进行PCR反应,其产物的测序胶银染结果足以用来分辨基因的差异表达。随后,采用DD—PCR技术对家蝇卵在外源基因导入后的基因表达情况做了研究,结果如下:1.转基因处理的蝇卵在分化开始之前,基因的表达与未经转基因处理的蝇卵存在着差异;2.以TnMA为锚定引物,共发现6条差异表达的片段,并且成功地克隆得到其中3条。经序列分析,证实其中2条为新基因,1条为家蝇细胞色素C的编码基因;3.将Delta Kit反转录产物与获得的细胞色素C编码基因片段杂交,证实在转基因处理组和对照组中都有该基因的表达。说明该基因可能在表达量上存在差异;4.以点杂交的方法对2条新基因进行了鉴定,确证它们来自于家蝇的基因组;5.获得的新基因已登录于GenBank,登录号分别为:AY030235,AY030236。结果表明,DD-PCR是一种用以分离差异表达基因和新基因的有效方法。在以转基因影响宿主细胞内调控机制的变化为着眼点的研究中,完整、清晰的cDNA指纹图谱再现了经过不同处理样本间的差别。我们的研究结果,为解释外源基因在宿主细胞内的去向,发现宿主内部对目的基因整合和分解的相关因素提供了可能,并为系统地开展相关研究打下基础。……   
[关键词]:家蝇;转基因;差异显示;基因表达
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:中国人民解放军军需大学2001年