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雄原核注射sMTPGH基因小鼠胚胎的体外培养

孙燕

  转基因动物的建立是一项复杂而艰苦的工作,提高转基因动物的生产效率一直是多年来转基因研究的重点之一。将转基因胚胎在体外培养至可供移植的桑格或囊胚阶段,并在移植入受体之前对其进行检测无疑可以极大地提高转基因动物的生产效率,对转基因动物建立具有重要意义。鉴于此,实验采用显微注射法生产小鼠转基因胚胎,并采用体外培养体系将其培养至囊胚,然后对囊胚期胚胎外源基因整合情况进行了研究,以期为进一步探索转基因胚胎植入受体前的体外培养和在大动物进行转基因的检测提供依据。实验采用质粒sMTPGH转化感受态细胞,大量提取转化菌落细菌DNA,经Hind Ⅲ和EcoRⅠ酶切鉴定后,纯化经Hind Ⅲ酶切的线状DNA片段用于显微注射,导入受精卵雄原核。由58只超数排卵处理的小鼠获得卵母细胞1697枚,从中选取可用于显微注射的原核期受精卵1278枚。使用纯化的羊金属硫蛋白(sMT)控制下的猪生长激素(PGH)基因为显微注射片段,在显微操作仪下用自制的显微工具针将其导入受精卵原核,经体外37℃、5%CO_2、饱和湿度条件下短暂培养后,存活的胚胎率为30.67%。实验还比较了几种不同培养液对克服小鼠胚胎2-细胞发育阻滞及卵裂率、囊胚率的效果。采用改进的M16培养液(用mM16表示)能有效克服2-细胞阻滞现象,并使体外培养的转外源基因1-细胞小鼠胚胎发育到桑椹胚或囊胚阶段。在mM16培养液的基础上,再加入表皮生长因子(EGF),可使1-细胞胚胎发育到囊胚的比率进一步提高。在三种培养液(M16、mM16、mM16+EGF)中转外源基因胚胎越过2-细胞阻断期的比率分别为12%、68%、90%,发育到囊胚的百分率分别是0、20%和43%。实验采用PCR方法检测了57枚经体外培养发育至囊胚的转基因胚,有4枚检测扩增出阳性条带,外源基因在囊胚期胚胎的整合率为7%。尽管PCR技术可能带来假阳性结果,需进一步的实验以验证4枚PCR阳性胚中外源基因是以游离片段的形式存在,或是整合到了胚胎基因组中。但如果能在囊胚期筛选出转基因阳性胚,则可能有目的地进行移植,避免盲目性。……   
[关键词]:sMTPGH;显微注射;转基因;胚胎体外培养;2-细胞阻断;PCR
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:西南农业大学2001年
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